α-生育酚琥珀酸酯通过NFκB信号途径诱导erbB2表达乳腺癌细胞调亡及研究.pdfVIP

中文摘要 癌细胞凋亡 摘 要 目的：维生素E同系物是一类具有预凋亡活性的维生素E的衍生物， 其中以仅一生育酚琥珀酸酯(0【．tocopheryl 证明咖TOS能够引发多种肿瘤细胞凋亡，并且对恶性肿瘤细胞具有高度 选择性而对正常细胞没有毒性，使之成为一种有前途的肿瘤预防及治疗药 l％， 物。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占妇女肿瘤的3 其中1 因子受体家族成员之一，它参与抑制细胞凋亡，维持或促进肿瘤细胞生长。 因此erbB2表达乳腺癌恶性程度较高。常规治疗乳腺癌的方法包括手术、 化疗和内分泌治疗等，而erbB2表达的乳腺癌对许多化疗药物不敏感。 氨酸蛋白激酶Akt的自动活化。Akt引起核转录因子心(nuclerfactor-r,B， 的激活导致其易位进入细胞核并结合到某些特定基因的启动子区域，例如 与IAP和FLIP基因的启动子区域结合，从而使肿瘤细胞能抵抗凋亡。因 此，抑制erbB2表达乳腺癌细胞的NFr．B活性的药物具有临床治疗意义。 最近，发现a．TOS能够诱导erbB2表达的乳腺癌细胞的凋亡。所以本实验 达)为模型，通过测定Akt的活性，NFrd3 p65的核移位，caspase的活性， 过NFrd3信号途径诱导erbB2表达乳腺癌细胞的凋亡。 时，在细胞培养基中加入不同浓度的仅．TOS。药物处理一定时间后，收集 中文摘要 细胞进行实验。 2 理时间结束后加入MTT 数据分析，计算细胞半数抑制浓度(IC50)值，并以a．TOS浓度为横坐标， 生长抑制率为纵坐标作图。 细胞生长抑制率(％)=(对照组平均OD值一处理组平均OD值)／ 对照组平均OD值X100％ 3Hoechst染色观察细胞凋亡形态取无菌盖玻片置于6孔板内， 汇合。加a．TOS刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0．5ml固定液， 固定10分钟。去固定液，用PBS洗2次，每次3分钟，吸尽液体。加入 Hoechst 0．5ml 次3分钟，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细 胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。荧光显微镜观察染色结 果，并拍照。 4免疫印迹收集细胞，使用蛋白提取试剂提取细胞总蛋白。蛋白质 样品变性后，使用10％SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜。 膜封闭后加入一抗孵育，然后进一步加入辣根过氧化物酶标记的二抗继续 孵育。用D．actin或组蛋白1抗体作为蛋白质的加样对照。 5 扩增，PCR扩增运行30个循环。扩增c-IAPl的引物对为：上游引物： 下游引物： 230 bp；扩增FLIP的上游引物为：5 扩 增 的 上 游 引 物 为 ： bp； 13-actin 5’．TGACGGGGTCACCCACACTGTGCC．3’， 下游 引 物 为 ： 5’．CTAGAAGC 中文摘要 662 在25山反应体系共30个循环。 6 8活性测定 通过裂解酶底物显色来测定 caspase3和caspase caspase3和caspase 和 (acetyl—Asp-Glu-Val—Aspp-nitroanilide) (acetyl—Ile—Glu·Thr-Aspp．nitroanilide)。大约3 —pNA(2 mmol／L)反应缓冲液，并在37℃ mmol／L)或Ac．IETD-pNA(2 光度