鸽肝线粒体DNA的研究.pdfVIP

．荆专HEREDITAS(B泣且＿9公 19-21一19竺 鸽肝线粒体DNA 的研究 I.纯化及电镜观察 曹新文 邹国林 李兆隆1)未汝潘 武（汉大学生物系） 线粒体 DNA(mtDNA）是研究环状DNA 肝，浸人预冷的缓冲液A(0-40C）中，剪去脂肪 复制、转录及其调控的一个较好模型，而且 及结缔组织后迅速称重。 将肝组织剪碎成小 mtDNA存在一些有别于细胞核DNA的特性。 块，以肝重 10倍体积的缓冲液A分4次洗去血 此外 mtDNA与核 DNA还表现协作效应。 污及胆汁，尔后置组织捣碎器中，加 10倍体积 迄今为止哺乳类及真菌的mtDNA已研究较 的缓冲液A，捣碎3-5分钟。将此粗匀浆液再 多L6-131，但对鸟类的mtDNA研究尚少II-［a10鸽 用玻璃匀浆器匀浆 每（次上下各20次），取1滴 肝mtDNA的研究，国内尚未见报道。本文就 匀浆液在显微镜下检查细胞的破碎程度，以保 这方面的工作先作一初步的报道。 证全部细胞破碎。然后用缓冲液A稀释匀浆液 至最终体积为肝重的20倍，800Xg离心20分 材 料 和 方 法 钟，再用相差显微镜检查，以保证去核完全。取 一（）材料 上清液，15,000Xg离心40分钟，沉淀出线粒 1．家鸽 (Columbaliviadomestica)肝脏。 体。 将线粒体沉淀再悬浮于适量缓冲液A中， 2.供试缓冲液 再离心纯化1次。然后将线粒体悬浮于缓冲液 缓冲液A：0.25M 蔗糖-5mMTris·HCl- B中 （缓冲液用量按每克肝 IMI计算）。加牛 1mMEDTA(pH7.4)o 胰 DNaseI至浓度达 100Fag/ml，在25℃水浴 缓冲液B;0.25M 蔗糖一，0mMTris·HCl- 中保温30分钟，以除去吸附在线粒体表面的核 7mMMgCIa(pH7.5)o DNA。保温后冰浴冷却至。℃，加二倍体积的 缓冲液 C;IOmMNaCI-50mMTris·HCl- 0.25M蔗糖-0.1MEDTA(pH8.0)酶终止液， lOmMEDTA(pH8.5)o 30,000Xg离心20分钟，将沉淀再用上述溶液 缓冲液 D;2MNaC1-IOmMTris·HCl-lm 悬浮后重复离心1次，倾去上清液，将沉淀放置 MEDTA(PH8.5)o 于4℃冰箱过夜或立即提取 mtDNA, 缓冲液 E;IOmMNaCI-IOmAITris·HCl- (2)mtDNA的纯化 将线粒体悬浮于 ImMEDTA(pH7.6)o 缓冲液C中 体（积按每克肝 IMI计算），加人 二（）方法 1.mtDNA的纯化 mtDNA制备基本 CaoXinwenetal.:Studieson the Mitochondrial 按文献[3]的方法进行，只作了部分的修改。 DNAofPigeon(Columbalivtadomestica)Liver (1）线粒体的制备：将1-3岁的家鸽，实 1.PurificationandElectronmicroscopic Observation 1)木系生化专业85届毕业生。 验前1天空腹，次日从颈动脉放血杀死，剖腹取 本文于1985年12月4日收到。 19