黑木耳ISSR—PCR反应体系的正交优化.pdfVIP

维普资讯 茵物研究2005，3(4)：15—18 JournalofFungaIResearchVol。3，No。4，2005 ISSN 1672—3538 黑木耳 ISSR．PCR反应体系的正交优化 唐利华，肖 扬，边银丙 华中农业大学应用真菌研究所，湖北 武汉430070 摘 要：采用正交试验设计的方法，对黑木耳 ISSR—PCR(简单重复序列区间 多聚酶链反应)反应体系,t-的 5种主要因素(Taq聚合酶，M ，模板DNA，dlWP及引物)4个水平进行优化筛选，确立了适合黑木耳ISSR分 析的优化反应体系(20t*L)，通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。 关键词 ：黑木耳 ；ISSR-PCR；正爻设计 ；梯度 PCR 中图分类号：$646．6；Q78 文献标识码：A 文章编号：1672—3538(2005)04—0015—04 ISSR(Inter—SimpleSequenceRepeat，简单重复 供)、97．1(陕西汉中植物研究所提供)、C21(陕西 序列区间)标记技术的基本原理是利用在 3或者 微生物研究所提供)、C22(陕西微生物研究所提 5端加锚了l～4个随机碱基的引物，对两侧具有 供)、173(陕西西乡食用菌研究所提供)和 186(陕 反向排列的简单序列重复 (SimpleSequenceRe． 西西乡食用菌研究所提供)8个菌株用于反应体 peat，SSR)间的基因组片段进行扩增…。由于 IS 系稳定性检测。 sR技术具有稳定性高，简单快捷等特点，已经广 1．2 试剂和仪器 泛应用于植物的品种鉴定、遗传作图和遗传多样 ISSR-PCR反应所用的 酶，dNTP及 DNA 性等方面的研究 2。黑木耳 [Auricularauricular marker(DL2000)均购 自TaKaRa(宝)生物工程 (大 (L．exHook．)Underw．]是我国最早人工栽培的食 连)有限公司。选用的引物P3购 自上海生工生物 用菌L3J，目前还未见 ISSR标记技术用于黑木耳研 工程公司。PCR仪为德 国 Biometra公司的T1 究的报道。ISSR标记技术受许多因素的影响，本 Thermocycler，梯度PCR仪为 日本的TAKARAPCR 研究采用正交试验设计的方法 ，对黑木耳 IS． THERMALCYCU￡RDICE。 sR反应体系进行优化筛选，并对PCR反应程序中 1．3 DNA提取 的退火温度进行梯度比较。 采用 SDS(十二烷基硫酸钠)裂解法提取总 DNA，用 1．O％的琼脂糖电泳检测 DNA质量，DNA 1 材料和方法 浓度与纯度用 Biophotometer核酸检测仪 (Eppen． 1．1 供试菌株 dorf)测定 ，并将DNA浓度稀释为50ng／btL。 菌株东A，1(黑龙江省微生物研究所提供)用 1．4 PCR正交试验设计 于反应体系优化试验。菌株新科 5号(华中农业 采用Ll6(45)正交试验设计 ，对 DNA聚合酶， 大学菌种中心提供)、新科 1号(湖北随州市海斌 dNTP，引物，M 浓度及模板 DNA浓度进行5因 菌种总厂提供)、植 5(陕西汉中植物研究所提 素4水平的筛选分析(表 l和表2)。 基金项 目：中国食用菌协会招标研究项日 作者简介：唐利华(1978-)，男，硕士研究生，主要从事食用菌生物技术与分子生物学研究。 收稿 日期：2005—1o-12 ★通讯作者：边银丙，E—mail：bianyinbing@mail．hzau，cdu．cn