15腐败菌的鉴定.docxVIP

食品加工流通岗位专家——李平兰2012年度工作成果一、发表论文情况2012年度本团队共发表论文2篇，会议摘要1篇：桂萌,王洋,张小栓,李平兰*,彭朝晖.北京鲟鱼、鲑鳟鱼加工产业调研与分析. 中国水产,2012(11): 32-34Kang Zhou, Meng Gui, Pinglan Li*, Shaohua Xing, Tingting Cui, Zhaohui Peng.Effect of combined function of temperature and water activity on the growth of vibrio harveyi. Brazilian Journal of Microbiology.2012, online桂萌,宋居易,章志超,李平兰*.鲟鱼硫酸软骨素在老年人生理保健中的作用.第二届老年营养与食品学术研讨会论文集.2012:176-177二、技术试验报告见附件1附件1 鲟鱼4℃储藏过程中微生物变化规律分析及腐败菌鉴定（食品加工与流通岗位专家——李平兰）1材料与方法1.1鲟鱼鱼糜的制备鲜活淡水养殖鲟鱼，每尾重700～1000g，购于北京回龙观海鲜市场。鱼糜加工工艺如下：鲜活鱼→冲洗→挑选→击晕→前处理（去头、放血、去鳞、去鳃、去内脏）→清洗→去皮→去骨→清洗→切片→绞碎→分装（真空包装）1.2 贮藏与取样处理后的样品冷藏于4℃冰箱，分别于第0，2，4，6，8，10天时取样，每次随机抽取2袋用于微生物及理化指标分析。1.3 微生物指标的测定微生物指标的测定采用GB4789.2—2008食品卫生微生物学检验，从真空包装鱼糜中无菌取样25g，加入装有灭菌玻璃珠的225mL无菌生理盐水中，在180r/min下混匀10min，进行10倍梯度稀释，选择三个合适的稀释度进行倾注法平板计数，每个稀释度3个平行。不同的微生物菌群采用不同的选择性培养基和培养方法，具体见表1。表 1 鲟鱼鱼糜4℃储藏过程中微生物的分析方法微生物菌落培养基培养温度（℃）培养时间（天）菌落总数PCA琼脂302肠杆菌结晶紫中性红胆盐琼脂 VRBDA362耐冷菌CVT203假单胞菌CFC252气单胞菌氨苄青霉素琼脂302弧菌TCBS302乳酸菌MRS362热杀索丝菌STAA252芽孢杆菌营养琼脂3621.4理化指标的测定1.4.1 pH值的测定取5g混合肉泥，加45mL蒸馏水，均质，浸渍30min后，采用Sartorius PB-10型pH计测定样品pH值，每个样品设置3个平行。1.4.2 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定按照GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》微量扩散法进行，每个样品设置2个平时。1.5 腐败菌的鉴定1.5.1 腐败菌的分离选取腐败终点的鱼肉样品，采用平板计数琼脂（PCA）30℃有氧培养48h。选取菌落总数在30～100的平板，分离整个平板一半的菌株或整个平板的所有菌株。肉眼观察菌落特征完全相同的菌落，并计数，数量最多的2～3种菌株作为优势菌，采用营养琼脂划线纯化，挑取单个菌落经涂片、染色、镜检，证实为纯菌株，将其接种到PCA液体培养基中，即得纯培养物。1.5.2 腐败菌的形态学观察及生理生化鉴定对筛选得到的菌株进行革兰氏染色，并在光学显微镜下观察其形态，确定得到单一菌种后，对纯菌株用微量生化管做生理生化鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册]中的指标进行初步对比和鉴定。1.5.3腐败菌基于16SrRNA分子生物学鉴定首先制备细菌总DNA[12]，之后以受试菌株基因组DNA为PCR反应模板。用于PCR体系扩增的引物为一对通用引物，正向引物为27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物为1495r(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3’)。PCR反应体系(25μL)为：10×buffer 2.5μL，dNTP 2μL，前引物2.5μL，后引物2.5μL，Taq酶0.25μL，模板DNA 1.0μL。PCR反应条件为：94℃初变性5min，94℃，1min；55℃，30s；72℃，1.5min；30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物送往北京博迈德科技发展有限公司测序，所得序列在NCBIhttp://www.网站中用同blast/中用BLAST进行同源性比对，用SeqnConverter 3.0和MEGA3.1软件构建系统发育树。2 结果与分析2.1 鲟鱼4℃储藏过程中微生物数量的变化2.1.1菌落总数的变化图 1 鲟鱼鱼糜4℃储藏过程中菌落总数的变化图1显示的是鲟鱼鱼糜在4℃储藏温度下总菌数的变化规律。一般认为，鲜活鱼的肌肉、内脏和体液应该是无菌的，但皮肤和腮等部位与水体接触，附着细菌较多。研究表明刚捕获淡水鱼的初始菌数在2～6 lo