紫外线灭活的原生质体作为饲养层培养柑橘原生质体的研究.pdfVIP

， - — — 74—— 江苏农业科学 2009年第 6期 紫外线灭活的原生质体作为饲养层培养 柑橘原生质体的研究 徐小勇 ，刘继红 (1．扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州225009；2．华中农业大学／作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉430070) 摘要：使用紫外线 (uV)照射来源于柑橘愈伤组织的原生质体，使之灭活后，作为饲养层培养 目标原生质体。结 果表明，uV照射的原生质体作为饲养层能促进来源于愈伤组织的原生质体的生长，而对叶肉原生质体的生长无促进 作用。本研究建立的培养方式可用于柑橘融合产物培养或低密度原生质体培养 ，也可为其他作物的原生质体培养作 参考。 关键词 ：柑橘 ；原生质体；饲养层 ；紫外线 中图分类号：$666 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2009)06—0074—02 原生质体培养需要一定的培养密度，低于一定密度 (约 表 1 试验所用的材料品种 lO 个／nd)时，培养的原生质体不会分裂和生长。在非对称 融合中，融合形成的异源融合细胞群体密度 比较低，且原生质 体融合前的预处理对其再生和分化存在很大的负面影响，这 是非对称融合面临的普遍问题 Vardi等使用 射线灭活的 柑橘原生质体作为饲养层培养非对称融合后的原生质体，最 后得到了胞质杂种植株 。除了 射线，x射线也被用于 灭活作为饲养层的原生质体 。然而 射线 、x射线应用的 1．3 原生质体分 离与纯化 设备比较昂贵，而且操作比较繁琐，因此很大程度上限制了这 参照Grosser等的方法 稍作修改：胚性悬浮系继代6～ 项技术 的广泛应用 。 10d的愈伤组织，吸取大约 1g悬浮培养物于 15mm×60mm 笔者就紫外线(UV)处理柑橘原生质体作饲养层的效果 培养皿中，吸干培养基，加入 1．5m1左右的0．7mol／LEME 进行了初步研究，以期建立新型的培养方式，达到促进柑橘原 (MT+蔗糖0．7mol／L+ME1500m#L)培养基，再逐滴加入 生质体生长发育的目的= 等量的酶液 (1％纤维素酶 R一1O+1．5％离析酶 R—l0+ 12．8％甘露醇 十0．12％MES+0．26％ CaC1，，pH值5．6，过滤 1 材料与方法 灭菌)。取充分 展开 的叶片，放入预先加入 1．5ml左右 1．1 材料 0．6molZLEME(MT+蔗糖0．6mol／L+ME1500m#L)培养 材料见表 1，共有 1种柑橘愈伤组织 (保存于MT基本培 基的培养皿中，用刀片将叶片切成细条状，再逐滴加入等量的 养基中，每30d继代 1次)和3个柑橘品种的试管苗。 酶液 (同上)，然后置于约30r／rain的低速摇床或暗培养箱中 1．2 无菌试管苗的获得 酶解 16～20h(温度皆为28qC)。酶解好的原生质体通过孑L 把成熟种子置于 2％NaC10溶液中，消毒 12rain左右， 径为36tzm的不锈钢筛网过滤，滤液在 100g离心 10rain，弃 无菌蒸馏水清洗 3次，去种皮，播于MT基本培养基中，20～ 上清，沉淀用 13％甘露醇一26％蔗糖界面法 100g离心2～ 30d后取叶片用于分离原生质体。 3min。用吸管将两液面问的原生质体移出，电融合液离心洗 涤 8rain，然后悬浮于电融合液中备用。 收稿 日期：2009—03—24 1．4 紫外线 (UV)辐射处理 基金项 目：国家 自然科