白藜芦醇对肝癌细胞血管内皮生长因子表达的影响.pdfVIP

陕西 中医2009年第 3O卷第 12期 1667 白藜芦醇对肝癌细胞血管 内皮生长因子表达的影响 孙中杰 余海波 张 煜 刘晓刚 杜立学 陕西省人 民医院肝胆外科 (西安 710068) 摘 要 目的：观察 白藜芦醇对HepG。细胞血管内皮生长 因子表达的影响，初步探讨 Res抑制肝 癌细胞侵袭转移 的机制。方法：RT—PCR、WesternBlot实验检测 Res对 HepG 细胞 VEGFmRNA和蛋 白表达的影响。结果 ：不同浓度的Res作用于HepG2细胞后能明显下 调VEGFmRNA及蛋 白的表达。结论：Res能下调HepG。细胞VEGF的表达，可能具有 抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。 主题词 肝癌 ／中医药疗法 白藜芦醇 ／药效学 实验研 究 肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，侵袭转移是影响肝癌 上游 引物 ：5’一TTGCCTTGCTGCTCTACCTC3’(exon一1)， 预后的主要因素 。阐明肝癌侵袭转移 的机制 ，寻求有效的抗侵 VEGF 下 游 引 物 ：5’一TGCATGGTGA TGTTGGACTC 3’ 袭转移的治疗措施，对改善肝癌患者的预后具有重要意义。白 (exon一3)，扩 增 片 段 为 280bp；GAPDH 上 游 引 物 ：5’ 藜芦醇 (resveratrol，Res)是一种在葡萄、水果和蓼科植物 的根 TCCTGCACCACCAACTGCTT 3’(exon一6)，GAPDH 下游 引 部提取 出来 的一种多酚类化合物 ，能抑制血小板聚集 ，具有抗 物 ：5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA一3’(exon一8)扩增片段 氧化、抗炎的作用 ，深入研究发现 白藜芦醇具有抗肿瘤作用，对 为 527bp。实验重复 3次 。PCR产物经 1．5 琼脂 电泳，用凝胶 肝癌细胞有 明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用 ，但鲜有抑制肝 成像分析系统分析结果，以VEGF基 因片段与 GAPDH片段灰 癌侵袭转移 的报道。本实验通过研究 白藜芦醇对 HepG 细胞血 度值 的比值作为其相对表达水平数值 。 管内皮生长因子 (VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF) 1．2．2 WesternBlot检测 VEGF蛋 白的表达 ：收集各组 表达的影响，初步探讨 Res抑制肝癌细胞侵袭转移的机制。 处理的细胞 ，每 5×10细胞加入 200t~L细胞裂解液 ，并轻轻晃 1 材料和方法 动 ，使裂解液尽量接触到所有细胞 ，12000rpm离心 15min，取上 1．1 实验材料 清液 ，100℃加热 5min使蛋 白变性 ，测浓度分装备用 。分别制备 1．1．1 细胞株 ：人肝癌 HepGz细胞 ，西安交通大学第一附 12 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离胶和浓缩胶 。上 属医院肝胆外科实验室传代保存 。用 100mL／L胎牛血清 的 样 30p．g后 电泳 ，然后恒流 300mA转膜 75min。转移后 的硝酸纤 RPMI一1640培养液 ，在 37℃，50mL／LCO2培养箱 中培养 。取 维膜经 5 脱 脂奶粉 室温封 闭 lh，然 后与 1：1000兔抗 人 对数生长期的细胞进行实验 。 VEGF抗体 ，4℃孵育过夜，接着加 1：1000标记的二抗 ，室温反 1．1．2 试 剂 ：白藜 芦 醇 Sigma产 品；RPMI一1640含 应 90min，化学发光法检测 ，暗室压片爆光 ，显影定影后胶片保 100mL ·L。胎牛血清培养液 ，购于Gibco公司；逆转录试剂盒、 存并进行灰度分析 ，应用 Genetools分析软件 ，VEGF阳性条带 PCRMix及蛋 白marker购 自Invitrogen公司，VEGF兔抗