实时荧光定量PCR检测人APRILmRNA的标准品构建.pdfVIP

维普资讯 · 14 · 交通医学2007年第 21卷第 1期 MedJofCommunicat ，oQ， !1211 !! [文章编号]1006—2440(2007)01—0014—03 实时荧光定量 PCR检测人APRILmRNA的标准品构建 王 行 王惠民 王旭 东 鞠 少卿 祝文彩 张冬雷 (南通大学附属医院检验科 ，南通大学公共卫生学院，江苏 226001) 摘要 目的：构建增殖诱导配体(APRIL)基因的重组质粒的标准 品。方法 ：从肺癌 的组织标本 中抽提总RNA 逆转录合成 eDNA，以eDNA为模板扩增 目的片段 ．从胶 中回收 目的片段 ，再将 回收的目的片段与 pGEM—TEasy 载体连接并转化宿主菌 DH一5 ，分别用菌落 PCR及测序两种方法证实 目的片段已成功转染细菌 。抽提重组质粒 DNA用核酸分析仪测浓度后换算成 copies／ml。结果：成功构建 了APRIL实时荧光定量标准 品的线性范围 105～ 10~·copies／m1．批内与批间CV分别为 1．34％～3．07％和7．24％～l1．4l％。结论：该法制备的质粒标准品具有较好的灵 敏度和重复性，满足实时荧光定量实验要求。 关键词 增殖诱导配体 ；聚合酶链反应；质粒标准品；T—A克隆 中图分类号 Q813 ConstructionofthestandardsfordetectingAPRIL withreal-timefluorescencequantitative polymerasechainreaction WANGXing，WANGHuimin，WANGXudong，etal(AffiliatedHospitalofNantongUniversity，SchoolofPublicHeal~，NantongUni— versity，Jiangsu226001) Abstract Objective：ToconstructthestandardrecombinantplasmidsforAPRILgeneandusingofrquantification．Methods：Total RNAwasextractedfrom thetissuesoflungcancerandthencDNA wassynthesizedbyreversetranscription．Targetsequencewasampli- fledrfom cDNA and thenthePCR productwasGelextractedandpurified．ProductsofpurificationligatedwithpGEM-TEasyvector， andtransformed intocompetent DH一5 ．TwomethodsofcolonyPCR and sequencingwereusedtoverify thetargetfragmentsare transformed successfully．Plasmid DNA isextracted and cDNA plasmid concentrationsaremeasured spectrophotometricallyand then converted to copies／mlaccording the equation．Reslllts：Construction ofAPRIL standard forreal—time fluorescence quantitation is achievedsuccessfully．Thestandard haswidedetectionrange，andthecoefficientsofvariationvalueforboth intraassayand interassay reproducibilityrangerfom 1．34％~3．07％ and 7．24％~11．41