HCT8细胞中GCS基因的表达和化疗耐药的关系研究.pdfVIP

to Athesissubmitted University Zhengzhou forthe ofMaster degree The 究 或 体 根 门 大 缩 位 州 摘要 HCT-8细胞中GCS基因的表达和化疗耐药的关系 研究生：张保华 导 师：臧卫东教授 宋敏副教授 郑州大学基础医学院人体解剖学教研室 (郑州450001) 摘要 背景与目的 化疗是临床治疗结肠癌的常用疗法，但是长期化疗引起的药物敏感性降低 是影响肿瘤化疗效果及预后的重要因素。肿瘤细胞可以通过多种不同途径产生 耐药，目前的研究主要关注于P．糖蛋白、多药耐药相关蛋白、热休克蛋白、肺 耐药相关蛋白等。近来神经酰胺在多药耐药形成中的作用逐渐引起了学者的注 意。葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)是葡萄糖转移酶的一种，它可以是神经酰 胺糖基化为GIcCer，逃避神经酰胺介导的凋亡作用减少细胞凋亡，因此产生耐 药。不少文献报道GCS与乳腺癌、胃癌和黑色素瘤等细胞耐药的产生有关，但 其在结肠癌细胞耐药形成中的作用目前研究的并不多。 因此我们进行本研究，通过RNA干扰沉默HCT-8／V的葡萄糖神经酰胺合 成酶(GCS)研究其耐药机制。本研究首先在结肠癌耐药细胞系HCT-8Ⅳ中转 shRNA 染UGCG Plasmid(h)(靶向沉默GCS基因的载体)，然后筛选建立稳 定的细胞系，采用RT．PCR和WesternBlot检测其沉默效果，应用CCK．8检测 其生长曲线和药物敏感性的变化，应用流式细胞术检测细胞凋亡情况，并进一 步研究其机制。本课题从基因、蛋白等方面研究GCS与结肠癌耐药产生的关系， 并运用RNA干扰技术观察能否逆转结肠癌的化疗耐药，为临床克服结肠癌化疗 耐药，提供一定的理论方向。 方法 lHC■8细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI．1640培养基中，常规传代培 I 摘要 以维持其相应的耐药表型。开始测定前撤药，进行无药培养2周。 2UGCG shRNAPlasmid转染HCT-8／VCR细胞，100J_tg／ml嘌呤霉素的培养 基进行筛选，建立转染后稳定传代细胞系。 3用细胞活性(Cell kit．8，CCK．8)法检测转染前后生长曲线和 Counting 药物敏感性的变化。 4用RT-PCR和WesternBlot检测其沉默效果，并进一步研究GCS蛋白的 表达和P—gp及Caspase·3蛋白的关系。 5用流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果 l shRNAPlasmid后细胞的生长 CCK8检测显示与转染前比较，转染UGCG 曲线基本相似，没有明显差异；而顺铂(DDP)IC50降低，敏感性增高。 2 shRNAPlasmid后细胞的 RT-PCR和Westemblot结果显示转染UGCG 了GCS的表达。 3 s