Rotor Gene 3000荧光定量PCR仪标准操作流程.docVIP

Corbett Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪标准操作流程 关键词： 荧光定量,RT-pcr,Rot ?? 3000,Corbett ?? ?????????????????????????????????????? 背景知识：Rotor-Gene是一套实时显示DNA扩增和杂交过程的循环变温系统。该装置能在其36孔转轮上容纳36个0.2 ml的标准离心管。72孔的转头还能装上一种特殊的四联管，这种0.1 ml的小管4个连在一起。整个反应过程中，转头都以500转/分钟的速度保持离心旋转。注意：转头旋转时要装满管子，不管是72孔还是36孔的转头。如果样品管数不够，将空管填满转头，这将保证在旋转时每管受热的均一性，保证实验结果准确性。Rotor-Gene有4个不同波长的LED激发光源，以及有4个检测通道：通道1用于510 nm检测，通道2用于550 nm检测，通道3用于585 nm检测，通道4用于625 nm检测从而允许四种不同样品被同时激发检测。当样品管转到检测通道时，高能量的LED发出激光激发样品，PMT检测器收集信号。 主体内容：1. 软件打开以后自动弹出 “New Run”窗口。选择了合适的程序以后，按键。主要参考文献：2. 选择所用的转子类型：36孔或72孔，并确认没有使用圆盖的PCR管。然后单击进入下一步。3. 填入操作者的名称以及反应的备注信息（这两项可不填），并键入反应体积。按进入下一步骤。4. 选择“Edit Profile”进入程序设置。4.1在“Edit Profile”窗口中，通过，，键增加或删除反应步骤。要更改每个步骤的内容，则先选定该步骤，再对各步骤的温度，时间设置进行更改。Insert before：允许在选定的项目之前插入一个步骤，比如在循环体之前加入一个保温过程Insert after：允许在选定的项目之后插入一个步骤，比如加入一个熔解曲线Remove：从列表中去除不要的步骤Denature：设置变性温度和时间Cycling：设置循环次数Melt：设置起止温度及每一个温度的持续时间在设置“Cycling”内容时，窗口如下；该步除对反应时间，温度进行设置，还需要设定在哪步读取荧光，单击“Acquiring to Cycling A” 或“Not Acquiring”按钮会弹出“Acquisition”对话框，用[]，[] 和 [] 键在两个窗口中移动通道，所有列在右边的通道都是机器运行时时要采集信号的通道。按 键确认结束对话。如果在这个循环步骤不采集荧光，则点击Dont Acquire键。通过＋，— 按钮可以增加或减少Cycling中的步骤，每个Cycling最多可设置5步。点击“OK”回到上一界面。4.2 功能允许设置每一通道的灵敏度。设定反应需要采集荧光的温度，选择在哪一步运行校正程序，然后选择需要校正的通道，按键，仪器自动进行校正，完成后按结束对话。5. 按键进入下一步骤，确认了反应设置后，按开始反应。6．此时会弹出文件保存窗口，该文件包括一次运行的所有信息。7．选定保存后，自动弹出样品编辑窗口。该操作窗口用于定义放入转轮内的样品。转轮上的数字对应于操作窗口中的样品号。有以下几种样品类型：None：该位置无样品。NTC：阴性对照。Sample：待测样品。Standard：标准样品（已知浓度）。known Conc：每个标准品的浓度，可以是10进制原始数据，也可以是对数值。完全的样品描述可以存储成样品文件，便于以后类似文件的设置。每一样品可以选用不同的颜色代表。该窗口的设置可以在整个反应过程中，以及反应完成后进行调整更改。通过依次点击〈View〉〈sample〉进入该窗口，或是通过右击窗口右边的样品栏可以进入。8．程序运行后，可以在软件界面上实时观察到如下的窗口：分别显示原始的荧光信号收集界面，温度界面和反应进程界面，窗口右边是样品信息栏。通过此界面可以实时检测PCR反应，知道反应剩余时间，以及升降温情况。样品信息栏中：显示目前列表中所有样品不显示目前列表中所有样品显示所有命名的样品显示所有36或72个样品不显示所有36或72个样品图表窗口中：允许手动调整最大最小值自动调整图表数值范围回复到默认值(0-100单位)9．反应完成后，单击“Analysis”菜单，弹出“Analysis”窗口。选择所需要的分析方法，如：定量分析，熔解曲线分析等之后，按键，则可以在窗口中看到相关图表结果。10．对结果进行分析以后，选择“Report”菜单，可以得到分析结果的报告。通过，， 等按钮可以打印，保存和把报告发到电子邮箱中，也可以把报告以Word的形式输出，此时只需要选择按钮即可。