关于RNA相关操作技术总结.pptVIP

* * RNA 相关操作技术 RNA相关技术 主要包括： RNA 提取、电泳技术 RNA逆转录合成cDNA 体外转录合成RNA RNA杂交——Northern杂交 原位杂交技术 基因芯片技术 cDNA文库的构建 RNA概述 细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5μg RNA，其中： 80%-85%为rRNA 15%-20%为tRNA及sRNA mRNA约占总RNA 的1%-5% rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。 RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。 1、mRNA的分离纯化 PolyA T-tract mRNA的分离纯化过程简图。 2、逆转录合成cDNA 构建cDNA文库 3、Northern 杂交技术 基本原理：Northern杂交是研究真核细胞基因表达的基本方 法。其基本原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖 凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和 用探针进行杂交检测。 主要用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA） 及其含量。 Northern杂交基本操作流程 1）RNA变性及电泳 氢氧化甲基汞（很好的变性剂，但具有挥发性，且有毒） 乙二醛/甲酰胺 甲醛和甲酰胺对RNA进行预处理，后在含2.2M甲醛的凝 胶中电泳 2）RNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 3）核酸探针的标记及杂交 4）洗膜与检测 4、RNA原位杂交技术（in situ hybridization, ISH） RNA原位杂交用放射性或非放射性（如DIG、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。 负对照，mRNA的同义链, 无杂交信号。 正对照，UBQ10 杂交信号遍布于整个胚珠。 RNA原位杂交基本操作流程 （一）用石蜡包埋材料 1）材料的固定： 固定液：FAA固定液、多聚甲醛固定液 固定的材料不宜过大，否则固定液不易渗透 抽气：抽气、放气宜缓，尽量避免对细胞造成伤害 材料在固定液中浸泡的时间不宜过长，否则杂交信号会 减弱 2）脱水 将乙醇或戊二醇配制成由低到高的浓度梯度，对固定好的材 料进行逐级处理。 如： 50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→90%乙醇→100%乙醇 3）透明 完全脱水的材料经下列二甲苯梯度处理（用乙醇配制） 25%，1h→50%，1h→75%，1h→100%，1h，重复两次 4）包埋 将石蜡切成小碎片，加入到材料中（浸泡在二甲苯中）至饱 和，42℃放置一天，58~60 ℃放置两天，期间换3~4次石蜡，最 后将材料和石蜡一起倒入小纸盒中，凝固后，4 ℃保存。 （二）切片和展片 切片厚度7~10 微米 （三）探针的制备 体外转录合成sense探针、antisense探针（DIG RNA labeling kit），探针浓度100~400ng/ul为宜 （四）材料脱蜡和复水 脱蜡：100%二甲苯→33%二甲苯 复水： 100%乙醇→10%乙醇→水 （五）杂交 杂交液由A和B组成，每张片子大约需100~150ul杂交液； 在0.3M NaCl-50%甲酰胺溶液形成的湿室中，42℃杂交过夜。 （六）洗片 用RNase A对材料进行处理 （七）显色 加入anti-DIG-Ap，进行显色；镜检，拍照 蛋白相关操作技术 一、蛋白与DNA相互作用 （一）酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 该技术是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 基本原理：将顺式作用元件与最基本启动子（minimal p