氧自由基对肿瘤影响.docVIP

1]孔德升.组织因子途径抑制物-2及其结构域1的基因克隆、表达和功能研究[D].复旦大学,2006.组织因子途径抑制物一2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)，又称胎盘蛋白一5(placentaprotein-5，PP-5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(matrixassociatedserineproteaseinhibitor,MSPI)，是一种带有kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员，由于与组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)的结构非常相似，故此得名。成熟的人TFPI-2(humanTFPI-2，hTFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串联的三个kunfiz结构域和富含碱性氨基酸的C端组成，体外实验发现它能抑制胰蛋白酶、纤溶酶、糜蛋白酶、血浆缓激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G等多种蛋白酶的活性，但对凝血因子Vna(FVIIa)／组织因子(tissuefactor,TF)复合物、凝血因子Xa(FXa)、t-PA(tissue-typeplasminogenactivator)及uPA(urokinase-typevlasminogenactivator)的抑制作用不明显。 已知TFPI的三个结构域有其各自的功能，如结构域1与FVIIa／TF结合并抑制其功能；结构域2与FXa结合并抑制其功能；结构域3与肝素、CDl4、LRP(10Wdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP)和gp330结合，发挥抗炎、协助抗凝、促进TFPI代谢等作用。从理论上推测，hTFPI-2既然与TFPI结构类似，它的三个结构域也应该具有独立的功能，但这些功能是什么则需要大量的实验证实。 研究表明hTFPI-2能够抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、胶质细胞瘤等多种恶性肿瘤的侵袭转移，也能够抑制动脉粥样硬化斑块的脱落。因此，hTFPI-2有可能作为一种新型蛋白质药物，在治疗肿瘤转移和动脉粥样硬化并发症方面具有潜在的应用前景。 但是，TFPI-2的生理功能迄今未知，极大地妨碍了它的应用。由于TFPI-2是一种存在于细胞外基质中的蛋白酶抑制因子，对于细胞外基质的重塑发挥重要的调节作用，因此人们认为TFPI-2可能和细胞运动、胚胎发育、伤口愈合、肿瘤转移和动脉粥样硬化等生理病理过程具有密切的关系。应用分子生物学技术在模式生物中定向敲除(knockout)某个特定基因，然后观察实验动物的整体结构、功能和生理状态的变化，已成为研究基因功能的重要方法。因此，鉴于TFPI-2的研究现状，有必要采用模式生物详细研究TFPI一2的生理功能，从而对该蛋白的理论研究和应用开发提供更多的理论知识。 我们以人胎盘组织总RNA为模板，用RT-PCR获得hTFPI-2的cDNA基因，通过与原核表达载体重组，实现了hTFPI-2在大肠杆菌中的高效表达，目的蛋白以包涵体形式存在于菌体内，表达量占全菌总蛋白的20％一30％，经复性、纯化后hTFPI-2的纯度大于90％，产率约为20-30mg／L。性质研究表明复性后的hTFPI-2具有抑制胰蛋白酶、纤溶酶、MMP-2和MMP-9的活性，同时亦具有抑制纤维肉瘤细胞HT-1080侵袭转移的能力。 本研究还探索了采用酵母表达系统制备hTFPI-2第一个Kunitz结构域(hTFPI-2／KD)的工艺路线，并在此基础上研究了hTFPI-2／KDl的功能和结构。研究初期，我们按常规方法把hTFPI-2／KDl的野生型基因转入毕赤酵母体内，但表达结果并不理想。在分析了hTFPI-2／KDl编码序列的特点之后，我们发现其中含有较多的酵母稀有密码子，因此推测密码子的偏好性可能是制约该蛋白在酵母体内表达的原因之一。我们利用PCR的方法按照毕赤酵母密码子使用的偏好性优化了hTFPI-2／KDl的编码基因，将其与毕赤酵母表达载体pPIC9K重组，用电转化的方法使重组质粒转入毕赤酵母体内，筛选出高拷贝的转化子。种子菌经两次放大后，在30L发酵罐中用甲醇诱导表达，诱导40小时后目的蛋白表达量达到高峰，并且以可溶形式存在于培养上清中。培养上清依次经超滤、分子筛、离子交换等纯化步骤进行纯化。纯化后的目的蛋白纯度达到96％，产量为20mg/L左右。发色底物法检测显示，hTFPI-2／KDl对纤溶酶和胰蛋白酶都具有明显的抑制作用。应用明胶酶谱法观察到hTFPI-2／KDl对MMP-2和MMP-9均具有抑制作用；Matrigel法观察到hTFPI-2／KDl能够降低纤维肉瘤细胞HT-1080的体外侵袭能力。 我们联合应用斑马鱼基因组数据库、生物信息学、RT-PCR和RACE等方法率先