短发夹状RNA抑制GCS基因在人乳腺癌细胞表达及逆转其多药耐药.pdfVIP

短发夹状 RNA 抑制 GCS 基因在人乳腺癌细胞的表达 及逆转其多药耐药* 孙妍琳 周庚寅 林晓燕 李 红 白艳花 张翠娟 (山东大学医学院病理学教研室,济南 250012） 摘要: 目的 构建葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase, GCS ） 基因的短发夹状 RNA （shRNA）,观察其对人耐药乳腺癌细胞 GCS 表达的抑制及多 药耐药的逆转作用。方法 设计两对 GCS 基因编码的反向重复序列，中间间隔 6 个 nt,体外合成并克隆至载体 pSUPER。转染乳腺癌细胞，Western blot 和免疫 细胞化学方法测定 GCS 表达。Western blot、比色法检测细胞内 caspase-3 的表 达，流式细胞仪分析细胞凋亡率。四氮唑盐（MTT）法检测半数细胞抑制浓度。 结果 酶切和 DNA 测序证实重组质粒构建成功。转染后 GCS 蛋白含量分别下降 80 ％、 82％， GCS 表达阳性率降低为 18.1％、16.7％。caspase-3 表达和活性均 显著增强，细胞凋亡率明显增加。细胞对化疗药物耐药性有明显下降。结论 shRNA 可有效抑制人耐药乳腺癌细胞中 GCS 表达，并可提高其对多种化疗药物的敏感 性。 关键词: 短发夹状 RNA;癌，乳腺细胞；葡萄糖神经酰胺合成酶；脱噬作用 1 引 言 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种近来发展起来的新技术，在人类 基因功能研究及基因治疗方面得到广泛应用[1,2] 。RNAi能够非常特异的降解与之 序列相应的单个内源基因的mRNA，无关基因不受影响，另外， RNAi以 19～21nt 小干扰RNA(siRNA)为中间产物，在酶复合体作用下高效率的降解mRNA[3]。 多药耐药（multidrug resistance, MDR）是指一种药物作用于肿瘤使之产 生耐药后，该肿瘤对未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物也具有 交叉耐药性 [4] 。MDR产生机制复杂，近年来葡萄糖神经酰胺合成酶 *基金项 目： 国家自然科学基金资助项目；高等学校博士学科点专项科研基金（20020422042 ）山 东省科技厅重点支持项目（022130112; 第一作者：山东大学医学院博士研究生 通讯作者：周庚寅，教授，博士生导师 1 （glucosylceramides synthase,GCS ）介导的凋亡调控与MDR方面的研究引起了 人们的关注。GCS催化UDP-glucose上的糖基与神经酰胺相结合，使细胞逃避神经 [5] 酰胺介导的促凋亡作用，对MDR的产生具有重要作用 。 我们利用转录载体 pSUPER 构建靶向 GCS 的短发夹状 RNA(small hairpin RNA,shRNA),研究其对人耐药乳腺癌细胞 GCS 基因的抑制作用，并观察其对多药 耐药的逆转作用。 2 材料与方法 2.1 材料 人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR及敏感细胞株MCF-7 均来源于美国国立 癌症研究所，质粒 pSUPER 购于美国 OligoEngine 公司，工具酶购于日本 TaKaRa 公司，质粒纯化试剂盒为美国 Qiagen 公司产品，脂质体为美国 GIBCO 公司产品。 GCS 单克隆抗体由美国 Mayo Clinic Center 的 David Marks 教授惠赠， β -actin 单克隆抗体为北京中杉生物工程公司产品，caspase-3 单克隆抗体和活性 测定试剂盒分别购自 Santa Cruz、Clontech 公司， ECL Western Blot 检测试 剂盒购自 Amersham Pharma