血清成分生化分析2.ppt

综合实验二： 血清成分的生化分析 实 验 六 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离及鉴定 生命与环境科学学院 生化组 实验材料 鸡血清 ：三黄鸡血清 或乌骨鸡血清 二、试剂及仪器用品 血清 PBS （NH4）2SO4溶液 蔗糖 双缩脲试剂 酪蛋白 BaCl2溶液 离心机 烧杯 移液管 透析袋 透析装置 三、试剂及仪器用品 （1）Sephandex G-25 （1）铁架台 （2）生理盐水 （2）凝胶柱 （3）重铬酸钾 （3）玻璃棒 （4）蓝葡聚糖 （4）烧杯 （5）试管 （6）胶头吸管 可通过凝胶过滤对样品脱盐 一、实验原理 二、操作方法 2.上样 3.检测 （1） 在收集的同时，检查蛋白质是否流出： *于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中(按编号顺序）； *再分别加入1滴20％磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱； *如此再检查到蛋白质全流出为止。 （2）与此同时，检测蛋白收集液中是否有硫酸铵： *再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中； *加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去， （3）合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。 二、凝胶柱层析原理 1、凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。 2、当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。 3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。 本实验采用Sephandex G-25凝胶柱分离重铬酸钾和蓝葡聚糖混合物。 Sephandex：葡聚糖凝胶。G20、G30······G200等，编号越小，筛孔越小。根据需要选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。 四、实验步骤 1、凝胶预处理 称取 8g G-25 → 放入250mL烧杯中 → 100mL蒸馏水→小火煮沸1h → 静止、冷却 → 倾弃蒸馏水→ 加入10mL PBS → 轻轻搅拌至凝胶悬起→ 倾入10cm×1.0cm层析柱。 2、装柱 将全部凝胶都倾入柱内，当液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出（4～5d/m），到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。 3、加样 用胶头吸管将柱中上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。 4、洗脱 用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到10～15d/m。 5、收集 混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。 ? 2.实验结论 实际洗脱曲线 例子 1.洗脱曲线 实验结果 五、实验结果 *盐析分离所得之γ-球蛋白，在进一步纯化之前，先要将其中的硫酸铵除去。凝胶过滤法较之透析法是一种快速有效的方法。 *当蛋白质、硫酸铵混合物流经Sephadex G-25 柱时，硫酸铵渗入 Sephadex G-25 内部，而蛋白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流出，硫酸铵后流出。故能将二者分开。 1．装柱 *取层析柱1根（1.5×20cm），垂直于固定架上，夹住流出口； *加10ml磷酸盐缓冲液（0.0175 mol/L，pH6.7）于柱中； *将溶胀好的Sephadex G－25倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液