H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达.pdfVIP

维普资讯 云南 大学学报 (自然 科学版 )，2007，29 (6)：623—627 CN 53—1045／N 0258—7971 JournalofYunnanUniversity H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达 王金萍 ，宋建领 ，张文东 ，李作生 ，冯子 良 ，胡媛媛 ， 郭松辉 ，张应 国 ，范泉水 ，宋学林 ，邱 薇 ，张富强 (1．云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224； 2．云南省动物疫病预防控制中心，云南 昆明 650051； 3．成都军区疾病预防控制中心 军事医学研究所 ，云南 昆明 650032) 摘要：根据已知H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计、合成克隆引物．自灭活的云南地方 H5N1亚型病毒阳性临床组织样品中提取总 RNA，反转录后采用高可信度 DNA聚合酶 (Pyobest DNAPoly． merase)扩增HA基因，采用 Invitrogen定向表达系统 (Champion pETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行 克隆表达，纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组 HA，分子质量约 78ku．采用阳性血清经免疫印迹及 ELISA分析重组HA的免疫反应性，结果表明重组HA能与 H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合，具有 良好 的免疫反应性 ． 关键词：禽流感病毒；H5N1亚型；血凝素；表达 中图分类号：S855．3 文献标识码：A 文章编号：0258—7971(2007)06—0623—05 禽流感病毒 (Avianinfluenzavirus，AIV)属于 性氨基酸数量及排列方式与毒株的毒力及组织嗜 正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)流感病毒属 (In． 性相关．本文在分析 H5N1亚型禽流感云南地方毒 fluenzavirus)A型流感病毒(InfluenzatypeAvirus— 株 HA 基 因 的基 础 上 ，对 A／Chicken／Yunnan／ es)成员，病毒粒子表面分布密集的钉状物或突起 K001／2004(H5N1)毒株 HA基因进行克隆表达， 物，包含血凝素和神经氨酸酶．病毒基因组由单股、 并采用阳性血清对表达产物的免疫反应性进行了 负链、8节段 RNA组成，编码 10个基因，按片段大 分析，以期获得高纯度重组抗原，用于筛选 H5亚 小依次为：聚合酶与 RNAm7G帽结合区(PB2)、 型特异性单克隆抗体． 聚合酶延伸区(PB1)、聚合酶(PA)、血凝素(HA)、 1 材料与方法 核蛋 白(NP)、神经氨酸酶 (NA)、基质蛋 白(M1， M2)、非结构蛋 白(NS1，NS2)．核蛋白、基质蛋 白抗 1．1 病毒、质粒与菌种 禽流感云南地方分离毒 原性差异是流感病毒分型的依据，血凝素和神经氨 株 A／Chicken／Yunnan／K001／2004 (H5N1)A／ 酸酶抗原性差异则作为A型流感病毒亚型划分的 Chicken／Yunnan／K017／2002(H9N2)灭活样 品，本 依据．目前已知血凝素共有 16种亚型(HI～H16)、 实验室鉴定 、保存；原核表达质粒 DET100／D— 神经氨酸酶共有 9种亚型(N1～N9)．HA是 由562 TOPO、大 肠埃 希 氏菌 TOP10及 BL21Star ～ 566个氨基酸组成，分子质量约为75ku的糖蛋 (DE3)购 自Invitrogen公司． 白，是 A型流感病毒主要表面抗原和保护性抗原． 1．2 主要试剂与材料 定 向表达试剂盒 (Cham． 禽流感病毒的突出生物学特性是高度变异，而其结 pion pET directionalTOPO expression kit．K100 构蛋 白又以HA的变异最为频繁．HA裂解位点碱 — 01)、辣根过氧化物酶 (HRP)及碱性磷酸酶 (AP