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转基因蓝藻生长繁殖状况及其外源基因稳定性研究 作者：王宇 指导老师 曾国寿 摘要 本文研究了不同条件下两种转基因蓝藻生长繁殖状况，以及外源基因的稳定性。与对照的7942集胞藻相比，转基因集胞藻MT与1146的生命活力随传代代数的增加呈下降趋势，其所含的外源基因也随传代代数的增加而逐渐丢失；在水培养条件下，转基因集胞藻MT与1146的生长状况也明显不如7942集胞藻。这说明了在没有筛选压时或在自然条件下转基因蓝藻对天然蓝藻无法造成生态位的入侵，证明转基因蓝藻作为生物反应器对环境来说是比较安全的。 关键词 蓝藻 外源基因 稳定性 蓝藻是藻类中最原始的类群，是具有植物型放氧光合作用的原核生物，结构简单、生长迅速、适应性强、部分种类具有天然转化系统和有效重组系统，以蓝藻为生物反应器，生产目的蛋白，具有周期短、成本低、易操作等优点。目前，已有不少外源基因转入蓝藻并得以表达的报道，如Tandeaude Marsac以pUC303为载体,在单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942中表达了原核基因芽孢杆菌杀幼蚊毒素基因[1]；Price等人通过穿梭表达载体pCA在蓝藻Synechococcussp.PCC7942中表达了人的碳酸酐酶基因,对蓝藻细胞的光合作用产生了一定影响[2]；孙军等人将小鼠金属硫蛋白-1(mMT-1)cDNA基因片段与穿梭质粒表达载体pDC-8重组,在固氮丝状蓝藻Anabaenasp.PCC7120中表达了金属硫蛋白[3]；闫艳春等人同样将抗性尖音库蚊酯酶B1基因与穿梭质粒表达载体pDC-8重组,在蓝藻Synechococcussp.PCC7942中表达了有活性的这种酯酶[4]等。 但是，和其他转基因物种一样，转基因蓝藻对环境的安全性问题引起了人们的关注，人们对转基因蓝藻从实验室或生产车间的泄漏及外源基因的逃逸是否会对生态环境造成不利影响心存疑虑。因此，本文通过研究两种转基因蓝藻的生长繁殖状况及其外源基因的稳定性来探讨这个问题。 1 材料和方法 1.1实验材料 1.1.1藻种 转入pUCMT质粒（含Ampr基因）的集胞藻（本文简称MT） 转入pAM1146质粒（（含）Ampr基因）的集胞藻（本文简称1146） 前两者的受体藻种集胞藻7942（本文简称7942） 1.2仪器与试剂 1.2.1 主要仪器 光照培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂SPX-300B-G型）；洁净工作台（ 上海淀山湖净化设备厂SDJ-CJ）；722型分光光栅光度计（中国厦门分析仪器厂）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂 TGL-16G）；电泳仪（六一仪器厂，DYYⅢ-5型）；PCR仪（Biometra公司，T Gradient）.2.2 试剂 1）BG-11培养基 2）LB细菌培养基 3）引物由上海博亚生物技术有限公司合成 5’端引物 5’GGC AAC TAT CTC AGC GAT CT 3’ 3’端引物 5’GTG TCG CCC TTA TTC CCT TT 3’ dNTP,Taq酶、CTAB等均购自上海博亚生物技术有限公司； DNA Marker(DL2000)购自大连宝生物公司。 1.3实验方法 1.3.1 7942、MT、1146继代培养（25℃与29℃） 7942、MT、1146接种于BG-11液体培养液，进行继代培养。培养条件为：温度25℃或29℃，光照强度为2700LUX，每日光照时间12h。 继代培养时各从每瓶所对应的前一代藻液取25ml分别置于75ml BG-11培养液中，以每9天为一代，进行培养。繁殖至第五代和第七代后，将编号为MT、1146、7942的第五代和第七代提取DNA、进行PCR 扩增，对比是否有Ampr基因。 1.3.2 7942、MT、1146长期不继代繁殖 将7942、MT、1146、MT7942、1146ml的锥形瓶盛装，置于恒温光照培养箱培养。培养条件为：25℃或29℃，光照强度为2700LUX, 每天光照时间12h。 在第35天时提取DNA，进行PCR 扩增，对比是否有Ampr基因。 1.3.3 在自然水中的培养 将MT、1146、7942、MT7942、1146ml：10ml的比例混合）；在温度为29℃,每天光照时间12h的条件下恒温培养。每1～3天记录一次其生长情况，研究对比MT，1146，7942在自然环境下的存活能力。并在显微镜下观察其生物种类及形态的变化。2—3个月后提取各样品的DNA，进行PCR 扩增，进行研究对比，是否有Ampr基因存在。 1.3.4 蓝藻 DNA的提取 藻液（OD730=0.5）欲1000rpm离心10min，弃上清（重复一次）；2%CTAB液（5ml/g）,65h;等体积氯仿/异戊醇抽提后离心10