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第六章 微生物的生长与控制 第一节 微生物的生长 一、微生物生长的概念 微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积增大的生物学过程，这是微生物个体生长的定义。 当微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起个体数量增加，这是微生物的繁殖。 由于微生物个体微小，生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。 二、微生物生长量的测定 （一）微生物细胞数目的测定方法 1．细胞总数计数法 细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般包括显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。 （1）显微镜直接计数法 这类方法是利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。 将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4～5个中格的菌体总数，并求出每个小格所含菌体的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。 （2）涂片计数法 用计数板附带的0.01mL吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有1cm2面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在1cm2面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出1cm2中的菌数，然后按1cm2面积上的菌液量和稀释度，计算每毫升原液中的含菌数。 （3）比浊法 比浊法是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度（或透光度）可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的菌悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器（如图6-2）。 2．活菌计数法 活菌计数法是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法，故又称平板计数法（如图6-3）。活菌计数法的特点是计算的结果是活菌落。在进行活菌计数时要注意样品的稀释度，保证一个活细胞可形成一个菌落。 （1）涂布平板法 用灭菌的涂布器将一定体积（不大于0.1mL）适当稀释度的菌液涂布在琼脂培养基的表面，然后保温培养到有菌落出现，记录菌落的数目并换算成每毫升试样中的活细胞数量。 （2）倒平板法 将样品稀释到一定浓度，取一定体积（0.1mL～1mL）倒入冷却至45℃的固体培养基中混合，然后倒入无菌平皿中制成平板，培养后出现菌落，由菌落数推算出活菌总数。 （3）滤膜过滤法 当待测样品中菌数很低时，可以将样品通过膜过滤器（如图6-4），然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。 测定微生物生长的相关生理指标，也可以间接的反应出微生物的生长量，常用以下方法来测定。 1．重量法 此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。 将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，离心后直接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。一般说来，干重为湿重的10%～20%。 2．体积测量法 体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。具体方法是取一定量的待测培养液（如10mL）放在有刻度的离心管中（如图6-5），设定一定的离心时间（如5min）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清液，测出上清液体积为V，则菌丝浓度为（10-V）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 3．测定菌种细胞内化学成分 测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂，操作困难，但较准确，菌种细胞内化学成分的多少，可反映出群体中菌体数量的多少。 （1）测定含氮量 微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标，大多数细菌的含氮量为其干重的12.5％，酵母菌为7.5％，霉菌为6.0％。根据其含氮量再乘以6.25，即可测得其粗蛋白的含量（包括了杂环氮和氧化型氮）。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%～80%，一般以65%为代表，因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算： （2）氨基氮的测定 具体方法是离心发酵液，取上清液，加入甲基