离子色谱法测定大肠癌患者尿液中甘露醇和乳果糖.docVIP

离子 付晓伶1， 周荣耀*1，潘广文(1.上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科，上海，201203 2. 戴安中国有限公司应用研究中心上海实验室，上海，201203） 摘要：高效离子样品经、净化、过滤后进行色谱分析，以-乙酸钠梯度淋洗液为流动相，流速mL/min，采用pac PA1（250 × mm）分离，（）检测，外标法定量。结果表明，的线性范围为mg/L，相关系数为0.999，回收率为91% ~ 102.6%，相对标准偏差均小于%，检出限为0.0 mg/L（以信噪比为3计）。该方法前处理简便，灵敏度高，用于，结果令人满意。 关键词：离子；； 1引言乳果糖、甘露醇在正常情况下不易被肠道吸收在尿中含量很少。在病理情况下肠粘膜受损细胞间的紧密连接破坏间隙扩大通透性增加通过细胞旁通道吸收的乳果糖(L)量明显增加穿过小肠上皮细胞水溶性微孔吸收的甘露醇(M) ，其吸收量变化甚微L与M的比值增大。LM可排除胃排空时间心输出量肾排出量及尿液收集等误差对检测结果的影响能真实地反映肠粘膜屏障通透性变化情况。大手术、创伤、烧伤、感染、脓毒症、肝硬化、放疗和化疗等应激可造成肠屏障结构和功能的损害肠通透性是评价肠屏障功能的一个重要指标。甘露醇和乳果糖被证明是能反映肠道屏障功能的有效方法。不同糖类pKa不同，根据糖类pKa的差异以及某些糖类与阴离子交换树脂之间的疏水性相互作用羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电量大小实现检测。该方法具有不用衍生、操作方便、灵敏度高、不使用有毒化学试剂和有机溶剂的优点，对糖类的检出限可以达到pmo数量级[1-4]。尿液中甘露醇和乳果糖的测定方法有多种，目前以气相色谱法[5]及高压液相色谱仪[6,7]为主, 常用检测器是ELSD、MS和 RID，但它们都存在繁琐、操作复杂或重复性不佳等缺点。 离子色谱—安培检测分离度好、灵敏度高、比UV-ELSD和UV-RID法优势明显。于博昊等[8]人采用离子色谱的方法曾对幼兔尿样中的甘露醇和乳果糖进行定性定量检测，结果表明，离子色谱法能有效糖醇，且方便、快捷，具有良好的稳定性和重复性。冯蕾等[9]人曾建立了固相萃取-高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法测定癌症患者尿液中异黄蝶呤的分析方法，能去除大量干扰物质，该方法具有灵敏度高、选择性好、对环境造成的二次污染小等特点。 因此，本文尝试采用高效阴离子交换—脉冲积分安培法分离人体尿液中甘露醇和乳果糖，并应用于大肠癌患者尿液的实际样品测试。实验部分 .1仪器、试剂与材料 Dionex ICS-3000离子色谱仪（美国戴安公司,包括四元梯度泵、金电极和安培检测器），Chromeleon 6.8色谱工作站，Barnstead-Nanopure纯水机，Anke TDL 80-2B离心机， CarboPac PA 1(250× 4 mm)分析柱，CarboPac PA 1(50 × 4 mm)保护柱，Onguard ⅡRP（2.5m），0.22 (m尼龙滤膜过滤头。 甘露醇（Augsburg Germany，批号：；乳果糖（中国药品生物制品检验所，批号100057-200601）；50%氢氧化钠（Fluka 公司）、乙酸钠（生化级，Fluka）；实验用水均为大于18.2 MΩ?cm的二次去离子水。 .2样品处理 2.2.1尿液收集 大肠癌患者于治疗前1天早晨, 排晨尿后，口服测试液50ml，(乳果糖15ml，10g甘露醇25ml，5g纯净水10ml)，连续6 h 收集尿液, 并计总量, 混匀, 各时段取1 m l,置于-20℃的保存。 .2.2标准溶液的配制 称取标样，用含20 mg/L NaN3超纯水配制1000 mg/L的甘露醇和乳果糖标准溶液，保存于冰箱冷藏室中。临用时稀释成100 mg/L，分别准确移取100 mg/L的甘露醇和乳果糖标准溶液各0 mL、0.2 mL、0.5mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL于100 mL容量瓶中，用水准确定容至刻度，配制成0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L不同质量浓度的标准工作溶液。 .2.3供试溶液的配制 抽取尿液样品，置于离心机中10000 r/min离心10 min，分别准确移取上清液1.0 mL，置于100mL容量瓶中，加水准确定容至刻度。混匀，溶液先经On guard ⅡRP柱子过滤，再经0.22 (m尼龙滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液供色谱测定。 2.色谱条件 梯度流速为1.0 mL/min；进样体积25 μL；金电极，脉冲积分安培检测，外标法定量。 结果与讨论 .1 实验条件考察 .1.1供试品预处理方法考察 根据文献[10]报道，尿液的组分复杂，健康人的尿液有形成分包括红细胞、白细胞、上皮细胞(