新型蛋白标记荧光探针合成及生物学测试.pdfVIP

新型蛋白标记荧光探针的合成及生物学测试 武祥龙，田敏，贺怀贞，韩洁，李剑利，史真* 西北大学化学系，陕西西安（710069 ） E-mail：wuxianglong309@ 摘 要：在甲基磺酸作用下，以 2 ，4-二氯间苯二酚和 3 ，6-二氯-4-羧基邻苯二甲酸酐 为原料缩合得荧光素母体。该荧光素母体依次和三甲基乙酸酐、二异丙基胺盐、盐酸、 三氟乙酸N-琥珀酰亚胺酯反应得到二新戊酸酯保护的荧光素N-琥珀酰亚胺酯。用6-氨 基己酸和荧光素 N-琥珀酰亚胺酯反应，然后用氨水脱去新戊酸酯保护基得到一种新型 蛋白标记荧光探针。目标产物及所有中间体通过 IR ，1HNMR ，MS 和元素分析表征。 对目标产物进行细胞标记生物学测试，并用共聚焦激光扫描显微镜扫描细胞图像，图像 显示该荧光探针具有很好的荧光性、光稳定性和生物相容性。 关键词：荧光素，荧光探针，细胞标记，共聚焦激光扫描显微镜，合成 中图分类号: O625 1. 引 言 荧光素是首次于 1871 年由Von Bayer 在氯化锌催化下通过间苯二酚和邻苯二甲酸酐缩 合而成[1]，其在水溶液中最大吸收波长和发射波长分别在492nm 和517nm，pH 大于8 时量 子产率高达0.92[2] 。由于荧光强度大，许多荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂，如5(6)- 羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯是应用最广泛的荧光衍生试剂[3] 。将荧光素以共 价键连接到多肽、核酸、寡聚核苷酸、蛋白质尤其是抗体、激素及其他生物分子上形成分子 [4] 荧光探针，用于生物学检测及基因表达 。荧光探针技术在分子生物学、微生物学、生物化 学、分析化学等领域有着广泛的应用[5~7] 。同时它的发展与生物技术、环境科学、诊断医学 等学科紧密相关，根据荧光探针的用途可将其分为极性探针、膜电位探针、离子荧光探针、 [8] 细胞骨架蛋白荧光探针等等 。 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)是上世纪 80 年代发展的先进的分子细胞生物学分析仪 [9] 器，它通过独特的成像原理与技术，使用紫外线或者可见光激发的荧光探针 ，可以观察固 定的细胞组织切片，甚至是活细胞的结构进行实时动态观察，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ [10] [11] 浓度 、pH 值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化 ，成为分子细胞生物学、神经科学、 药理学、遗传学等领域中强有力的工具。用荧光素探针标记的细胞、蛋白质等可以清楚的在 共聚焦激光扫描显微镜下成像。 因此，荧光素探针的合成和应用研究具有重要意义，本文以2 ，4-二氯间苯二酚和 3， 6-二氯-4-羧基邻苯二甲酸酐为原料，在甲基磺酸作用下缩合得荧光素母体，接入氨基酸连接 链得到一种新型含氯荧光素类蛋白标记荧光探针，其合成路线如Scheme 1 所示。 2. 实验部分 2.1 试剂和仪器 X-4 型数字显微熔点仪；德国产VarioELⅢCHNOS 元素分析仪；美国Varian 公司 INOVA-400 型核磁共振仪，溶剂为CDCl3 ，TMS 作内标。GC agilent6980MsHp5973 气相色 1 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金(No.20050697003)和国家自然科学基金(No的资 助。 - 1 - 谱质谱联用仪；MALDI-TOF MS(Kratos AXIMA-CFR plus Shimadzu Co.UK) 质谱仪； EQUINOXX55 型红外光谱仪，KBr 压片或涂片；共聚焦激光扫描显微镜(Bio-Red MRC-1024ES) ；F-4500 型荧光