针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应的研究平台技术优化与策略的研究.pdfVIP

针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应研究平台技术优化与 策略研究 杨波，高洋，严兴科 长春中医药大学针灸推拿学院实验中心，吉林长春（130117 ） E-mail ：yb301301301301301@126.com 摘 要：目的：为开展针灸治疗胃溃疡的蛋白质组研究，建立并优化其蛋白质组分析所需的 双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。 方法：对醋酸型胃溃疡大鼠进行针刺后取其 胃部溃疡处组织，对组织蛋白质的提取方法进行改进，优化双向凝胶电泳的关键因素与环节， 如样品的制备及预处理，第一向 IPG 等电聚焦的上样量及电泳参数，第二向垂直平板 SDS 凝胶浓度、染色方法等。利用PDQuest7.1 软件分析获得的二维凝胶图像。结果：以固相pH 梯度-IPG 胶条（pH3~10 ）进行第一向等电聚焦，以SDS 均一胶（12.5% ）的垂直电泳为第 二向，成功地得到了两组大鼠胃组织斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。结论： 通过对蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及优化，获得了适合于研究胃溃疡高分辨率、高重复 性的双向凝胶电泳图谱。 关键词：双向凝胶电泳；蛋白质组；SDS 凝胶电泳 1. 引言 蛋白质组学是应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门重要学科，采用蛋白质组分析应 用和技术可以识别及豁定一种细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式，从整体蛋 白质水平上在一个更加深入、更贴近生命活动本质的层次上去探讨一些重要的生理、病理现 象的本质。典型的蛋白质组研究有两个关键的步骤：①细胞或样品组织中蛋白质的分离，目 前最佳的分离方法是多维色谱技术和双向凝胶电泳(two-dimensinnal electrophoresis，2-DE) 。 ②蛋白序列的鉴定。常用质谱仪鉴别出多维色谱和2-DE 等分离出的差异蛋白是一己知蛋白， 还是一新蛋白[1-3] 。2-DE 建立于1975 年，30 余年的应用和发展使其技术渐于成熟，故在多 维色谱出现后，2-DE 仍被广泛采用，它是蛋白质组研究的基础，亦是当代研究的关键技术。 胃溃疡是一种世界性的常见病，人群中患病率高达5%-10%，亦有报告推测：每5 名男 ［］ 人和10 名女人中，可能有一人在他们的一生中患过本病，本病严重地危害了人们的健康 1 。 针灸治疗本病取得了较好的疗效，并具有简便、经济、安全、并发症发生率低和不易复发等 优势。而对于针灸治疗胃溃疡的疗效机制尚不清楚，运用蛋白质组学思维，以2-DE 为技术 手段研究针刺对应激性胃溃疡大鼠胃组织匀浆蛋白的影响，将有助于全面、真实地揭示胃溃 疡发生的病理过程以及针刺治疗本病的效应机理。 2. 材料和方法 2.1 材料： 2.1.1 实验动物： Wistar 大鼠60 只（长春高新医学动物实验中心），雄性，清洁级，体质量（200±30g ）。 2.1.2 仪器： 电动玻璃匀浆机(DY-89-II，宁波新芝仪器研究所) 、低温超速离心机 (Heraeus) 、电子天 平(FA1004，上海天平仪器厂) 、P20 、P100 、P1000 型精密移液器(GILSON)、MP3 多功能 微型垂直板电泳系统(Bio-Rad)、PROTEAN II xi Cell 垂直板电泳系统(Bio-Rad)、Power Pac - 1 - 200 和 1000 电源(Bio-Rad)、GS-800 光密度扫描仪(Bio-Rad)、IEF/SDS图像分析软件 PD Quest 7.3.1(Bio-Rad) 、SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器(上海象华化工有限公司) 、TY-B 型 多用脱色摇床(上海市新波无线电厂) 2.1.3 试剂： 17cm