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人端粒酶催化亚基反义寡核酸抑制子宫 内膜癌的实验研究 浙江大学医学院 妇科肿瘤 硕士研究生：陈学军 导 师： 郑伟教授 摘要 | i子宫内膜癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，约占女性生殖道癌瘤的 t 7赡，占女性生殖道恶性肿瘤的20％～30％。近20年来发病率呈逐年 上升趋势。子宫内膜癌的主要治疗方法为手术、放射及药物治疗，由于 癌变位于宫腔进展较缓慢，诊断时多为临床早期，手术切除或放射治疗 后早期子宫内膜癌的5年生存率达85*／*以上。如同其它所有恶性肿瘤， 晚期和复发性予宫内膜癌是治疗的难题，约有内膜癌10％～13％病灶 己扩散至子宫体外，此外早期内膜癌治疗后有l／4会出现复发；对于晚 期或复发性癌，目前主张结合手术、放疗及药物的综合治疗，但由于晚 期病变的广泛性和复杂性，以及病人相对较差的身体条件，病人往往不 能够耐受具极大破坏性的手术或放疗。孕激素以及现有的细胞毒性药物 的虽然有一定的治疗效果，但不能达到治愈，并且疗效的持续时间短， 所以目前药物治疗在子宫内膜癌治疗的地位仍然处于辅助治疗或者姑 塑垩查兰堡主丝兰 一—ll萎L一 息治疗的地位。几十年来对晚期癌的治疗方式进行了大量的研究和尝 试，但生存率仍然徘徊在原来的水平。 端粒酶作为一种逆转录酶，以其RNA亚单位为模板在自身的催化 亚单位作用下合成染色体末端的特殊结构——端粒，这对于维持染色体 稳定以及保证DNA复制的完整性有重要的作用。端粒酶的异常激活和 肿瘤的形成和发展密切相关，绝大多数恶性肿瘤表达端粒酶活性，而大 部分正常组织除胚胎组织生殖细胞、造血干细胞以及部分的粘膜上皮以 外都没有端粒酶活性的表达。内膜癌组织的端粒酶活性则持续激活，内 膜癌组织端粒酶阳性在95％以上。端粒酶活性高度表达与淋巴转移、手 术分期显著相关。单纯分析绝经后妇女的内膜癌，淋巴转移和端粒酶活 性高度相关，端粒酶活性水平与FIGO分期和FIGO分级显著相关；此 外，还与内膜癌的早期复发和术后快速进展有关，端粒酶活性可作为一 个独立的因素预后疾病的进展，有研究表明，抑制端粒酶能够影响内膜 癌的生长，提示以端粒酶为靶点治疗子宫内膜癌的可能性。 反义技术是近几十年来兴起的生物高技术，是反义技术封闭和抑制 特定基因的表达，是基因治疗的重要组成部分。由于AODN能与特定 基因按碱基配对原理结合RNA，抑镱《基因的表达，因此被认为是理想 的，具有精确选择性的靶向治疗药物，可广泛应用于多种疾病的治疗。 反义治疗与常规的基因治疗有所不同，AOND不改变细胞基因的结构， 不需要载体和病毒的介导作用。在动物模型和有选择的人类临床上取得 成功，目前已有十几种反义药物进入临床前及临床实验，证实反义基因 治疗潜在的临床应用价值。反义治疗应用范围广，涉及到遗传病、恶性 肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和免疫排斥等诸多病种。多项体外 及动物实验表明，端粒酶反义核酸能够抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，进 塑垩查兰堡圭丝苎 一——盟 而影响细胞的生长，针对端粒酶RNA设计的AODN能够延长肿瘤细胞 的细胞倍增时间，诱导细胞发生细胞凋亡。当把AODN直接注入移植 性肿瘤中，使肿瘤体积缩小，且具有剂量依赖性，提示端粒酶抑制剂作 为新型抗癌药物的可能性y 本研究以端粒酶催化亚单位基因hTERT为靶点设计合成硫代反义 寡核苷酸，评价反义核酸对子宫内膜癌HEC-IA细胞株的抑制作用。采 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法并绘制生长曲线检测AODN对细胞增殖 能力及细胞生长的影响；逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)、定量端 Blot蛋白免疫印迹法、凋亡相关 粒酶重复扩增法(TRAP)、Western CASPASE酶活性测定检测反义核酸对hTERT基因转录、蛋白表达、细 胞端粒酶活性以及CASPASE活性，探讨AODN抑制子宫内膜癌细胞的 作用机理。 ／体外实验结果表明：不同浓度的