Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用.pdfVIP

夏孝强等 Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用 第 11期 · 965 - · 分子与细胞免疫学 · Orai2蛋 白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用① 夏孝强 崔义元 李芳华 陈米娜② (四川大学华西医院／生物治疗国家重点实验室神经分子生物学实验室，成都610041) 中国图书分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2009)11．O965．04 [摘 要] 目的：原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白，获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体，用于Ore2 条件性基因敲除小鼠鉴定及 Ore2蛋白功能研究。方法：PCR扩增 OmJ2CDS编码序列 ，亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核 表达载体上，将编码Orai2的pGEX-6p-1一Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导GST-Om~融合蛋白表达，经 固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化，透析浓缩 ，获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白。SDS鉴定后 ，将纯化的融合 蛋白辅以弗氏佐剂，按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Westernblot检测抗体效价和特异性 ，并进行Orai2条件 性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定。结果：经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高，BCA蛋白定量检测试剂 盒测定蛋白浓度约0．35mg／n~。抗OreJ2多抗抗体效价达 1：10000。能特异性识别转染真核细胞获得的过表达 Orai2，以及小 鼠脑组织内源性的Orai2蛋 白，而不与 Orail发生交叉反应。同时，用 自制的Orai2多克隆抗体检测发现，与同窝野生型小鼠相 比， 2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低。结论：成功表达并纯化了GSY-Omi2融合蛋白，获得了高敏 感度 、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体，该抗Omi2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性 Orai2蛋白，能对 Orai2 条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定 ，且与Orail没有交叉反应，为进一步研究Orai2功能奠定了基础。 [关键词] Orai2；多克隆抗体；过表达；内源性；敲除小鼠鉴定 Expression，purification Orai2protein andpreparation，appfiaction it’spolyclonal na tibody XIAXiao—Q ，lg，CUlYi—Yuan，LIFang-Hua，CHEN 一Na．LaboratoryofMolecularNeurobiology，耽毗ChinaHospi- tal／StateKeyLaboratoryoftheBiotherapy，SichuanUniversity，Chengdu610041，China [Abstract] Objective：ToprepareGSI-Orai2fusionproteinandtopreparepolyelonalantibodyagainstOrai2byimmunizingrabbits．To furtherinvestigatethefunctionofOrai2，atransmembraneprotein，thisnatibodywasusedtoidentifytheOral2conditionalgeneknockoutmice． Methods：ORFofOral2wasamplifiedbyPCRnadsubelonedintopGEX-6p-1vector．AftertransformingB[21(DE3)competentcells，weSUC- ceededininducingtheexpressionofGST-Orai2fusionproteinusing Ⅱ ．ThentheGST-Orai2proteinwaspurifiedbyimmobilizedGlutathione affinitychromatographyandidentifiedbySDS．ANewEnglnadrabbitwasimmunizedwiththeprep~, fusionproteininFreund’sadju— vanttopreparespecificantibody．Finally，thepreparednatibodywas identifiedbyWestem blotbychecking