发育生物学石油对斑马鱼影响.docVIP

石油因子对斑马鱼胚胎发育的影响实验 摘要： 斑马鱼作为胚胎发育实验的模式生物，被用于化学混合物的急慢性毒性检测以及重金属的生物累积效应的研究等[1]。至今已证明斑马鱼是适合用于饱和诱变的唯一的脊椎动物。斑马鱼可与其他小型鱼混养，对食物不挑剔，各种动物性饲料、干饲料均可。该鱼很少患病 ，极易饲养 ，且具有产卵较量大、胚胎 发育速度快 、 胚体透明、 整个胚胎发育过程均可被直接观察等优点， 因而成为许多研究领域中的最佳模型之一[2]。而当前关于水域石油污染对 斑马鱼的毒理实验缺乏研究。本实验通过不同浓度石油烃对斑马鱼的影响作出了量化。 关键词：斑马鱼 石油 胚胎发育 毒性实验 1．前言： 当前漏油事件已经成为危害水域生态的主要来源，尤其是今年发生的两起漏油事件，5月5日的墨西哥湾原油泄露事件与7月16日的大连输油管爆炸事件再一次给世界敲响了警钟。一般石油烃化物污染水域时，高挥发性组分在阳光和风浪的作用下进入大气、多环芳香烃和部分烃类溶解进入水体，不溶解的组分在风浪的作用下形成乳化油进入水体，也可以被浮颗粒吸附进入水体。引起了世界各国的广泛关注，石油对水域生物的影响是非常显著的，因此有必要对石油引起的污染进行量化。 石油类污染物 主要是指原有以及以燃料油,润滑剂为主的工业油品[3],为有机 的混合物,按其结构可以分为四类:直链和支链烷烃,环烷烃,多环芳香烃和不饱和烃,分别属于脂肪烃,至环烃,芳香烃和异环族.链环烃是石油的主要成分,多呈不饱和状态.造成水污染的主要是溶于水,和以乳化状态或吸附于悬浮颗粒上的石油烃化合物,能被石油醚二氯甲烷 有机溶剂萃取.其中芳香烃易溶于水,构成了危害水生生物的主要部分.大分子不溶于水，短期毒性较小,但是毒性时间较长. 水域的表面出现油漂浮是石油污染的主要标志,此时水体的石油听含量可达到0.2mg/l以上,一般污染水体的石油听在0.03-0.1mol/l之间,水体表面的石油烃含量为表面水体以下的5-20倍. 石油烃对于不同生物的影响存在差异,石油类污染可导致水体交换不畅,容易导致水体缺氧,影响鱼类的呼吸和运动,导致鱼类的死亡,中毒鱼苗易造成弯体畸形.不溶的石油烃可以与水体形成水包油漂浮在水面，影响了光照的进入，使得初级生产力降低，干扰了水气交换，可以说对鱼类尤其是鱼卵的发育是致命的。 斑马鱼是一种小型热带淡水鱼 ，斑马鱼 ( danio rerio )是辐鳍亚纲(actinopterygii )鲤科( cyprinidae ) 短担尼鱼属( danio ) 的一种硬骨鱼。由于其生活周期短，行体外受精，体外发育，胚胎大而透明，易于观察。所以经常被用作胚胎发育的模式生物。 2．石油烃对斑马鱼胚胎发育的影响实验 2.1 实验仪器与试剂 烧杯，量筒、三角瓶若干。移液枪200ul，1000ul各一支。24孔多孔板18个，恒温箱，密封用透明胶带 等。 2.2实验动物 处于原肠胚时期的斑马鱼卵 2.3实验步骤 斑马鱼的饲养和产卵 1．选择亲鱼 选体形正常，体色发亮，鱼鳞和鳍无破损，游动灵活，捕食敏捷，无任何鱼病和异常行为的体长 4～5c m的 l2尾雌性和 l5尾雄性性成熟斑马鱼进行驯养。 2． 驯化 将雌、雄鱼分别驯养， 光周期为自昼 l4h与夜晚 10h ， 间隔投喂鱼虫和水蚯蚓 ，每 日2次，保证5min内吃光，及时的清楚排泄物和残留的食物并添加等量的经曝气的自来水。 3．配对 将亲鱼按照雌雄比为1:2放入水温保持在28±0.5摄氏度的孵化器中进行自行交配，曝气，光周期不变 4孵化 得到受精卵后隔离亲鱼，其他条件不变，改为微曝气，以免紊流损伤到受精卵 5毒性试验 为了尽量不免自来水中所含有的物质的干扰，整个实验过程中的水，均为统一配置，充氧饱和，曝气1天的自来水。按照OECD指导，设计胚胎毒性试验。 用量筒和烧杯配置不同浓度的石油水溶液[4]，浓度分别2mg/l,4mg/l,8mg/l。 浓度配置方案（原液32mg/l）(容量2ml)： 曝气自来水 石油烃原液（32mg/l） 2mg/l 1.875 0.125 4mg/l 1.75 0.25 8mg/l 1.50 0.50 *第一组用200ul移液枪，第2-3组用1000ul移液枪。 解剖镜下挑选发育一致的处于原肠胚期的胚胎，收集并用曝气的自来水冲洗两次，去除杂质，将鱼卵迅速暴露于受试溶液中并转移至12孔培养皿中， 每孔加入4ml试液，放3枚受精卵，前三孔为对照组，其他没三孔同一实验浓度． 以曝气稀释水为空白对照．实验卵为9*3=27枚，重组水空白对照卵为3*3=9枚，板加盖后用透明胶带封好，以避免蒸发而改变实验浓度，将多孔培养皿放置在恒温光照培养箱中培