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浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维 洪 健 徐 颖 浙江大学 2001 年10 月 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径 1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在 3-30nm 范围内。 在氯化金（HAuCl4 ）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同 种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最 初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多 的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的 1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm 的胶体金。因 此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残 留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2 ％的 H2O2 能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备 12～150 nm 直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备 12-16 nm 直径 的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理， 故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或 1g），因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml 试管分装为 1 ml 保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡 1 小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 μm 微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可 反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可 4 ℃保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如 出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备 3～16 nm 胶体金 (1) 取一 250 ml 三角瓶，加入 79 ml 双蒸水和 1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。 (2) 取一 50 ml 烧杯，加入 4 ml 1 ％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不 同用量的单宁酸及等量的25 mM K CO 。预热至60～70℃。K CO 的作用是保持 2 3 2 3 溶液的中性 pH 。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml 时，对pH 的影响不大，K2CO3 可以省略。 (3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。 1 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 柠檬酸钠（ml ） 单宁酸（μl ） 胶体金（nm ） 4 5000 3 4 2000 4 4 500 6 4 120 8 4