第六章 酶学基本知识和技术.docVIP

第七章 酶学分析技术 机体各种物质的代谢都是在酶的催化下完成的，酶的编码基因突变或表达异常，可导致酶分子缺陷，使代谢障碍，引起疾病；同样组织细胞的病变，也可导致酶活性的改变，因此酶学分析在临床诊断中具有重要意义。 第一节 酶活性测定的基本知识 酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质，它在体含量极微，每ml仅为pg水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相同对定量法。 一、酶活性的概念 酶活性是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即酶反应的速度。 如果在酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]的变化量对时间作图，可得到酶促反应时间进行曲线。 反应最新阶段，[S]过量，原始浓度很大。[P]或[S]的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内[P]或[S]的变化量或反应速度是恒定的，此阶段称为零级反应期。 其反应速度（v）与[S]、[P]无关，而以恒速进行。 即 －d [S]=Kodt 积分 得 [S]o－[S]t = Kot 以[S]o－[S]t对t作图可得一直线，其斜率为Ko，实际上[S]o－[S]t也就是t时产物[P]，故[P]和反应时间成正比，[P] = Kot。 一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。 二、酶活性单位 酶活性大小通常以单位来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，酶单位有三种表示方式。 1. 惯用单位 60年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。 这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如ALT的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位是定义不同，正常参考范围也不同。 King法：每100ml血清在37℃与底物作用60mim，每生成1μmol丙酮酸为一个酶活性单位。 Mohum法：1ml血清37℃与底物作用60mim每产生5μg丙酮酸为一个酶活性单位。 Reitmen法：套用Karman单位，在规定条件下（血清1ml，反应液总量3ml，25℃，作用1min，内径1cm比色杯）测定340nm波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。 2. 国际单位 1961年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU）是指在规定条件下（如25℃，最适pH，最适[S]时）每分钟催化1μmol底物发生反应的酶量。 1965年改为30℃，1972年取消时温度的规定。 缺点：1）由惯用单位换算成IU较麻烦 2）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。 3）同一种酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。 3. Katal单位 1972年国际酶学委员会又提出的一种新单位，是指在最适条件下，每秒钟催化1mol底物发生变化的酶量。 1 Kat=60×106IU 1 nKat=0.06IU 1 IU=16.67nKat 三、酶活性单位的计算 酶活性单位的计算，实际上就是计算单位时间内底物或产物的变化量。计算方式 如：血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L,用量1.0ml，血清0.02ml。 单位定义100ml血清37℃，作用15mim每水解5mg淀粉为一个淀粉酶单位。 如：已知产物或底物的吸光系数，可用下式计算： 终点法： 速率法： 如ALT测定速度法，NADH在340nm的摩尔吸光系数为6300，反应液（工作液）1.0ml，血清0.1ml，光径1cm。 四、酶促反应底物动力学 （一）米—曼方程 酶的活性除了受温度pH，抑制剂，激活剂等因素的影响外，还受底物浓度的影响，1913年Michaelis-Menten根据酶作用的中间产物学说，定量地分析了酶反应速度与底物浓度的关系，其数学表达式为： Km是3个速度常数的复合函数，在数值上相当于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 Km=[S] Km可表示酶与底物的亲和力，Km越大，表示E与S的亲和力越小反应，Km越小表示酶与S的亲和力越大。 Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、PH、离子强度）有关，而与酶的浓度无关，各种酶的Km一般在10－6～10－2mol/L之间 （二）Km的应用 1. 计算不同[S]时v为Vmax的百分率，如[S]=10 Km时 2. 确定酶反应中的底物浓度 为了使酶反应的速度接近Vmax一般要求 [S] =10～20Km，此时v =91％～95％Vmax 3. 作为鉴别酶的依据 如两种酶对同一底物（相同条件下）表现有相同的Km，则这两