金莲花种质遗传多样性的AFLP分析.docVIP

金莲花种质遗传多样性的AFLP分析* 李 勇 丁万隆** 陈士林 （中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所 北京 100094** （大连市药品检验所 大连 116021） 摘 要：金莲花是我国常用中药材品种，开展种质遗传多样性研究对新品种选育具有重要意义。本文利用AFLP标记技术对8份金莲花种质在基因组水平开展了遗传多样性分析，用POPGENE和NTSYS软件对统计结果进行遗传和聚类分析。从64对AFLP引物组合中筛选出的8对引物组合能够区分全部供试金莲花种质；研究结果表明，地理位置较近的金莲花种质，遗传相似系数较高；引种可造成金莲花种质的遗传结构发生变异。 关键词：AFLP 金莲花 遗传多样性 金莲花（Trollius chinensis Bge.），别名金梅草，金疙瘩，为毛茛科多年生植物，以花入药[1]。金莲花含有生物碱、黄酮甙、香豆素、挥发油、甾醇等药用成分，具有清热解毒、滋阴降火、养阴清热、消火杀菌等功效[2~3]，除药用外，还被开发成保健饮品，如金莲花茶等。近年，随着市场需求量的增长，野生金莲花储藏量逐年递减，金莲花野生资源受到严重威胁。 尽管有少数金莲花品种已有在平原地区成功引种栽培的报道[4]，但绝大部分野生金莲花种质仍处于濒危状态。丰富的种质资源遗传多样性是金莲花育种的前提和先决条件，金莲花野生种质消亡不仅极大影响金莲花优良品种的选育，还将导致金莲花对环境适应能力的降低，不利于金莲花种群的生息繁衍。开展不同产地野生及栽培金莲花种群的遗传多样性研究，对探讨金莲花濒危机制、建立合理的金莲花种质资源保护策略以及金莲花优良品种选育等具有重要意义[5]。 本文对采自河北、山西、北京郊区以及药用植物研究所引种栽培的8份金莲花种质开展了AFLP遗传多样性分析，研究了不同地理位置金莲花种质的遗传差异以及引种对金莲花种质遗传结构的影响，为今后开展金莲花种质资源保护及新品种选育提供了参考依据。 一、材料与方法 1. 植物材料 编号种质名称B 河北东灵山 T. chinensis 野生 —— D 山西庞泉沟 T. chinensis 野生 —— C 北京雾灵山 T. chinensis 野生 —— X 河北围场 T. chinensis 栽培 —— G 河北围场 T. chinensis 野生 —— S 河北五岳寨 T. chinensis 野生 —— W 北京栽培 T. chinensis 野生 采自雾灵山 T 北京栽培 T. chinensis 栽培 采自河北五岳寨 2. AFLP分析 模板DNA的制备 称取0.2 g金莲花新鲜叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国生物科技有限公司）提取金莲花基因组DNA。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的纯度和完整性，根据标准的λDNA浓度将提取的金莲花基因组DNA统一稀释为50 ng?μL-1。 （2）酶切和连接 反应体系为20 ul，包括：DNA（50 ng?μL-1）4 μL；Mse I?L-1）和EcoR I接头（50 pmol?L-1）各1 μL；EcoR IMse I内切酶（10 U?μL-1）各2 μL；10×R缓冲液2.5 μL；TP（10 mmol?L-1）2.5 μL；T4?μL-1）1 μL；μL。样品混匀后在37℃保温5 h，℃温浴15 min终止连接反应。取5 μL连接产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切连接是否成功，剩余反应物-20℃保存。 （3）预扩增和选择性扩增 预扩增25 uL，包括：模板DNA 2 μ；?μL-1）各1 μL；dNTPs?L-1）1 μL；10×PCR2.5 μL；Taq DNA?μL-1）0.5 μL，最后用ddH2O补足25 uL。预扩增：4℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 80 s30个循环；72℃5 min。将预扩产物×TE稀释作为扩模板选择性扩增25 μL，： 2 μL；10×PCR2.5 μL；dNTP?L-1）0.5 μL；EcoR IMse I引物?μL-1）各1 μL；Taq酶?μL-1）0.5 μL；25 uL。选择性扩增程序为：94℃ 30 s，65 30 s，72 80 s，12个循环，退火温度下降0.7℃/循环94℃ 30 s，55 30 s，72 80 s，23个循环；GeneAmp? PCR System 9600型（Perkin Elmer，Mse I引物和EcoR I引物 名称 核苷酸序列 核苷酸序列 5’-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3’ Mse I接头1 5’-GAC GAT GAG TCC TGA G-3’ EcoR I接头2 5’-AAT TGG TAC GCA GTC TAC-3’ Mse I接