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PCR技术的基本原理 / c6 i2 T3 X; `? ???类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍。扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为扩增效率, n为循环次数。( a# r6 f3 S9 m0 t/ X: Y# G* t　　在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。* n, D9 Q1 a3 S2 `) P8 `4 S每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理论上）。对于某些扩增片段很短的PCR反应，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。PCR方法及主要应用范围。 3 W# Q1 x8 `/ m/ S m+ i一、基本原理 8 S2 y% E+ d5 L: N8 }# }在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。 2 r/ ^( Q/ I- L是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下： + A [7 j$ V6 s9 F8 w G将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3端与5端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。 |- T7 E7 V6 W6 S! U二、参与PCR反应体系的因素及其作用 5 S# r??V `$ ^4 P4 D参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下： . \ d$ F7 j j- x1 x4 g* |一)模板核酸 Q- {, d) t% `. d用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。 3 o( r% D+ Z9 Y, c2 ~1 P `+ y# p6 [反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。 $ e4 [/ f$ X4 c% ~+ n. Z, J??b/ q, O9 q8 W??v??b$ g通常模板DNA用线性DNA分子，