RNA的提取84355.docVIP

RNA的提取、电泳及杂交 RNA的提取 (1) 称取1g左右的体细胞胚，液氮研磨，室温静止片刻，使液氮挥发。 (2) 将研磨后的材料加入预冷的含12ml变性液的50ml离心管中混匀。 400ml CSB缓冲液： 柠檬酸三钠 42mM 4.94g(含2水，MW=294.10) 十二烷基肌氨酸钠 0.83% 3.32g β-巯基乙醇 0.2mM 变性液: 异硫氰酸胍 25g CSB缓冲液 33ml 终浓度： 柠檬酸三钠 20mM 十二烷基肌氨酸钠 0.4% β-巯基乙醇 50(M 异硫氰酸胍 4M (3) 加入1.2ml乙酸钠(2M, pH4.0)，充分混合，以调节溶液pH至酸性，便于分离RNA。 2M乙酸钠(pH4.0)： 150ml 无水乙酸钠(MW=82.03) 24.6g 冰乙酸 约96ml (4) 加入8ml水饱和酚, 4ml氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，冰浴30min，中间振荡数次。 (5) 12000rpm 4℃离心20min。 (6) 上清液移入50ml离心管中，加等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30min以上。 (7) 12000rpm离心20min。 (8) 10ml 75％乙醇洗涤沉淀。 (9) 干燥沉淀，加变性液4ml，溶解沉淀。 (10) 加等体积异丙醇，-20℃静置30min(也可适当缩短沉淀时间)。 (11) 12000rpm 4℃离心10min。 (12) 吸去上清，用至少10ml 75%乙醇洗涤。 (13) 10000rpm 4℃离心5min。 (14) 洗去上清液，离心1min。干燥。 (15) 6ml DEPC-H2O溶解沉淀(若不易溶解，可加热片刻)。 (16) 等体积酸性酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，等体积氯仿:异戊醇(24:1)各抽提一次。 (17) 10000rpm离心5min。取上清加等体积异丙醇，1/10体积乙酸钠(3M, pH5.2)，混匀。 (18) 于-20℃静置30min以上。 (19) 12000rpm 4℃离心10min。 (20) 沉淀用5ml 75%乙醇洗涤。 (21) 10000rpm 4℃离心5min，吸去乙醇。再离心1min，吸净残留的乙醇。 (22) 沉淀干燥10min。 (23) 1ml DEPC-H2O溶解，-20℃保存。 (24) 取4μl提取的RNA，加996μl DEPC-H2O，紫外分光光度测定OD260和OD280。计算RNA的含量和纯度。 RNA浓度的计算：RNA (μg/μl)=OD260×10 RNA甲醛变性凝胶电泳 [1].用具的准备 电泳槽、胶模、梳子等用具经清洁精洗涤后，蒸馏水冲洗干净，2％SDS溶液浸泡过夜，双蒸水冲洗干净，经灭菌的DEPC dd.H2O 冲洗，无水已醇干燥后备用。 [2] 试剂配制 (1) 10×MOPS试剂[0.2mol/L MOPS(pH7.0)；80mmol/L乙酸钠；10mmol/L EDTA(pH8.0)] 将41.2g 3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)[3-(N-morpholinc) propane -sulfonic acid]800ml经DEPC处理的100mmol/L乙酸钠溶液。用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加20ml经用DEPC处理的0.5mol/L EDTA (pH8.0)，再加经DEPC处理的水至溶液总体积为1000ml。上述溶液经用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，避光保存于4℃冰箱。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不能使用。 (2) 甲醛凝胶加样缓冲液 50％甘油；1mmol/L EDTA(pH8.0)；0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯青FF。 [3]. 制备凝胶 将1.2g琼脂糖加入72 ml0.1%DEPC-dd.H2O，100℃熔胶，冷却至60℃后，加入10×MOPS 10ml，37%甲醛18 ml。在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置30 min或更长时间，使胶凝固。 [4]. 样品制备 在一经0.1%DEPC-dd.H2O处理并经灭菌的微量离心管内混合以下液体，以制备样品： RNA 40(g(6-8(l) 10(MOPS缓冲液 2.5(l 37％甲醛 4.0(1 甲酰胺 12.5(l 于65℃温育15 min，冰裕冷却，加入2.5(l甲醛凝胶加样缓冲液，混匀，离心5s，使所有液体集中于管底。1μl 10倍稀释的溴化乙啶(EB)混匀。 [5].预电泳 加样前，将凝胶浸