柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病关系的研究.docVIP

柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病关系的研究 文章发布者： 来源：寻医问药网 收藏本文 ???? 作者：张鹤萍 纪 辉 关振中 李 旋 牛美娟????单位：张鹤萍 关振中 李 旋 牛美娟 哈尔滨医科大学附属第二医院心内科，150086；纪 辉 黑龙江省嘉荫县人民医院????关键词：????中国急救医学991213 病毒性心肌炎和扩张型心肌病是心血管疾病中的常见病和多发病。许多学者的研究证实病毒性心肌炎的发病大部分与肠道病毒感染有关，尤其以柯萨奇病毒最为多见[1～4]，占心肌炎的40%～50%。关于扩张型心肌病的病因很复杂，可能与病毒感染、免疫障碍、神经体液因素、小血管病变、酗酒、遗传、中毒等因素有关。但目前有许多资料提示扩张型心肌病与病毒感染有关[5～8]，主张它是由CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果。确定病毒感染与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系，对两病的预防、诊断和治疗均具有指导意义。本实验用CBV3cDNA重组质粒PGP51BDNA片断，通过光敏生物素法制备CBV3cDNA核酸探针与心肌切片标本进行原位杂交，检测心肌组织中柯萨奇B组病毒核酸，证实了柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系。????1 材料与方法????1.1 CBV3重组质粒DNA(PGP51B) 哈医大微生物教研室。????1.2 待检标本 心肌石蜡包埋标本由哈尔滨医科大学附属第二医院病理科提供，经临床和病理检查确诊的心肌炎15例，扩张型心肌病7例。????1.3 CBV3cDNA核酸探针的制备 将含有CBV3cDNA重组质粒PGP51B进行质粒扩增，超速离心回收和纯化，用限制性内切酶PST切割，电洗脱，最后得到纯化的CBV3cDNA特异性片断，-30℃保存待用。cDNA片断采用光敏生物素法进行标记，主要步骤参考文献[9]。????1.4 原位杂交 方法简述如下，制备好的心肌组织石蜡切片用二甲苯脱蜡，乙醇水化，0.2 mol/L HCl室温处理20分钟，2×SSC(SSC：0.15 mol/ NaCl，0.015 mol/L柠檬酸钠)65℃处理20分钟，加入蛋白酶K(0.5 mol/L)，37℃消化15分钟，乙醇逐级脱水。加入预杂交液(50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s液、0.5 mg/mlxin新鲜变性的切变鲱精DNA、50 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 6.5、5 mmol/L EDTA)温盒内42℃～45℃预杂交3～4小时，CBV3cDNA探针100℃煮沸5分钟，浸入冰水中变性，加到心肌切片上，再加杂交液42℃过夜，用2×SSC室温洗5分钟，0.1%TritonX—100室温冲洗2分钟，PBS洗3次，每次10分钟。加显色底物NBT、BCLP 37℃水浴2小时，显微镜观察结果。????2 结果????15例临床确诊为病毒性心肌炎患者中，经心内膜心肌活检及光镜检查发现4例有早期心肌病的组织形态学改变，而7例临床确诊为扩张型心肌病的患者 中，经心内膜心肌活检及光镜下检查发现有4例组织形态学同时有心肌炎性改变，这一结果说明病毒性心肌炎和扩张型心肌病之间有一定关系。????2.1 紫外分光光度计法 将提取的重组质粒DNA用紫外分光光度计扫描在260 nM处出现吸收高峰，OD260为0.071，OD280为0.036，OD260/OD280比值为1.9，均达到标准纯度。因此，本实验提取的质粒DNA纯度及含量均符合要求。????2.2 琼脂糖凝胶电泳法 将提取的质粒DNA做琼脂糖凝电泳，结果如下：重组质粒DNA出现两条典型的主带，与DNA/Hind标准物区带相比可看出提取的质粒DNA含量多、纯度高。????2.3 显微镜下观察原位杂交的结果 我们用标记好的CBV3cDNA 探针检测心肌活检标本中的病毒核酸，发现15例组织形态学证实为病毒性心肌炎患者中有11例出现阳性杂交信号，呈兰色，位于受染细胞的胞浆及细胞内；7例 组织形态学证实为扩张型心肌病患者中有4例出现阳性杂交信号。并且4例有早期心肌病者有3例出现CBV阳性杂交信号，4例同时有心肌炎性改变者有2例出现 CBV阳性杂交信号。以上结果说明病毒性心肌炎和扩张型心肌病都与柯萨奇B组病毒感染心肌有关，部分扩张型心肌病是柯萨奇B组病毒感染心肌导致心肌炎进一 步发展的结果。????3 讨论????近年来，病毒性心肌炎和扩张型心肌病病例相应逐年增多，柯萨奇B组病毒引起的心肌炎动物模型已经证实，在心肌组织中病毒的增殖期仅1～2周，而组织的病理损伤可持续数周或更长[10]。因此，常规的血清学和病毒学方法对病毒性心脏疾病心肌组织中病毒或病毒特异性抗原的检测都是极端困难的[11～14]。而心内膜心肌活检可以从组织学上证实心肌炎，近年