APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT一116中的表达.pdfVIP

!!哇!壅巫壅量蝤述!Q塑生!旦筮!!鲞箜!塑鱼竺!竺曼竺竺!竺!垡哂!!塑型!Q塑!!生：!!!盟!：§ ·291· 基础研究· APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在 结肠癌细胞株HCT一116中的表达 吕梁霍继荣 刘佳张宏斌武捷王捷 【摘要】 目的 构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体 pEGFP—N3一APCI～5，转染人类结直肠癌细胞HCT-I16，观察重组质粒在细胞内的表达。方法根据 AP(：基凶的功能结构以及APC突变簇集区的特点，设计特异性引物扩增APC基冈特异性的功能区域片 段。将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP—N3载体的N端，经测序分析对重组质粒 pEGFP—N3一APCI～5进行鉴定。使用脂质体转染法将蕈组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT—116，通过观 察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达。以RT—PCR法进一步验证重 组质粒在细胞中的表达。结果构建5个pEGFP—N3一A咒结构区域的重组真核表达载体，重组真核表达 载体转染HCT-116细胞后，细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。RT—PCR结果显示，5个蕈组质粒在 HCT一1 16细胞中均可表达。结论真核细胞表达载体pEGFP—N3一APCI～5的成功构建，为进一步研究 其在细胞内的功能，筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础。 【关键词】基因，APC；重组质粒；聚合酶链反应；转染 Constructionof variousAPC pEGFP—N3-APCV∞to璐carrying functionaldomainsandtheir inHCT-116cellsLO Jia,ZHANG j证，WANGj论． expression Liang冉．HUOJi-rong,LIU Hong-bin,WU 2nd South 430010,China 4DepartmentofDigestion,theXiangyaHospital,CentralUniversity,Changsha author：HUO CorrespondingJi-rong,Email：hjrl98@hotmail．com Toconstructrecombinant variousfunctionaldomainsof 【Abstract】0bjective plasmidscontaining APC and in 16 APC detecttheir HCT—lcells．MethodsFive were protein expression genefragments PCRwithwholeAPC as and toAPCcDNA amplifiedby genetemplateprimersdesignedaccording sequence andmutationclusterdomain．Thefiveobtained wereclonedinto vector fragments eukaryotieexpression to recombinant l-5． oftheinsertedwasidentifiedand pEGFP-N3generate pECFP—N3一APCSequence gene afterrestriction recombinant was analyzed enzymedigestion．Liposome—mediatedplasmidpEGFP—N3一APC transf