不同核苷(酸)类似物治疗史的慢性HBV感染者的病毒聚合酶区基因变异研究论文.pdfVIP

第二届慢性乙型肝炎抗病毒治疗难点和热点学术会议汇编 不同核苷(酸)类似物治疗史的慢性HBV感染者的 病毒聚合酶区基因变异研究 杨方张明香魏倪潘洪洋杨桦林松 C 目前应用于慢性乙型肝炎(CHB)的治疗手段定量实时P R法，仪器为美国MJ公司生产的 尚无法达到彻底清除体内病毒的目的，因而长期或 永久抑制HBV复制成为目前治疗目标。核营(酸)类m1)，试剂为深圳匹基公司提供。 似物[nucleos(t)ide 4．统计学处理：用SPSS analogue，NAI的问世及其良好 13．0软件进行统计分 的抗病毒活性使这一目标的实现成为可能。但其长 析。符合正态分布的计量资料用均数4-标准差表示， 期应用可导致HBV—P基因逆转录酶(reverse其他用中位数表示，组间比较用方差分析或秩和检 transcriptase，RT)区变异而产生耐药问题，成为治验，P0．05为差异有统计学意义。 疗难点。PCR产物直接测序法可以同时进行多位点 结 果 变异检测…，其对于了解患者体内病毒种群的变异及 制订挽救方案具有重要意义。本研究对47l例进行 1．一般概况：471例患者的乙型肝炎病史时间为 6～480个月，中位数为96个月，有明确乙型肝炎家 了HBV-P-RT区基因序列分析的患者进行分析， 以期进一步了解耐药相关的变异特点，为今后指导 族史170例(36．1％)，全部血清HBVDNA阳性， 临床实践提供科学依据。 资料与方法 为初治患者治疗之前，49例(10．4％)为既往应用 1-病例来源：收集2007年5月-2010年2月于 沈阳市第六人民医院住院的CHB及相关肝硬化患者 2．测序时HBVDNA和ALT水平的对比研究： 471例，其中CHB患者255例，乙型肝炎肝硬化患对于既往未曾应用NA(组1)、曾经应用NA停药 者216例。男性355例，女性116例，年龄为10～(组2)以及正在应用NA(组3)3个组患者的血清 85岁，中位数为46岁。诊断标准符合我国2005年DNA含量及ALT水平进行比较分析，结果见表1。 制定的慢性乙型肝炎防治指南t21。 3．NA初始治疗患者治疗前的HBV—P—RT变异： 2．HBV—RT区基因序列分析：人院后空腹取静292例中检测到NA耐药的相关错义变异6例(2．0％)， 包括M204I3例、A181Tl例、V173L2例；同义 脉血，分离血清，置-70(2冰箱同批备检。采用天泽 基因病毒DNAOUT抽提HBV基因组，引物由我 室自行设计，包括介导PCR反应的内、外引物各2 组，PCR扩增病毒聚合酶RT区，PCR产物经琼脂(89．4％)均未检测到变异位点。 糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后，用美国ABI公司 4．既往应用NA治疗患者的HBV-P-RT变异： 3130全自动DNA测序仪上机电泳测序，结合每一49例患者曾经应用NA，但停药至少3个月。其中9 对正向及反向序列，与存储在HBV基因库的参考序 例(18．4％)检测到变异位点，包括经典耐药位点的 列自动比对从而获得样本的突变位点。 错义及同义变异，具体变异位点及既往用药史见表 DNA检测：入院 3．生物化学、血清学及HBV 2。其余40例(81．6％)未检测到变异。 后用美国Abbott公司生产的全自动生物化学分析仪 及配套试剂同时进行生物化学检测；HBV血清标志 物检测用酶联免疫吸附法，仪器为上海智华ST一360患者正于接受NA治疗的过程中，检测到NA相关 DNA定量检测采用荧光 酶标仪及配套试剂；HBV