猪的细胞培养及应用.docVIP

REVIEW 猪的细胞培养及应用 刘畅 李胜富 COZAAR6@163.COM 猪的细胞培养属于大动物的细胞培养，是将来自猪体的某些器官或组织的细胞，在模拟的体内生理条件下在体外进行培养，使之存活和生长。它作为细胞工程的基础之一，具有重要的作用。近年，猪的多种细胞系得以建立和广泛的应用，这主要是由于：①猪作为最具经济价值的家畜类动物之一被广泛饲养，其细胞及组织容易获得且与人体相似；②随着对猪到人异种移植研究的兴起，某些种系的猪及转基因猪显示出极高的医学价值，猪的细胞培养成为了重要的实验手段之一；③猪的某些细胞和组织本身具有一些特点，例如，猪的淋巴细胞亚群具有特殊的异质性，其未熟B细胞局限于回肠的Peyer氏斑，成为未成熟Ｂ细胞方便的来源[1]。 猪细胞培的现状 纵观大量的文献报道，已有三十余种猪的细胞被成功培养并应用于生物医学研究，现按其生长特性及形态归纳于下表。 表-1 已被培养及应用的猪细胞和组织 生长特性及形态 猪的细胞或组织 贴附型 成纤维细胞型 上皮样细胞型 游走型细胞型 多形性细胞型 成纤维细胞，内皮细胞（主动脉、脑毛细血管、角膜），破骨细胞，成釉样细胞，血管平滑肌细胞，虹膜组织，宫内膜细胞，胆管上皮细胞 角朊细胞，胃主细胞，胰岛细胞，脉络丛细胞，黄体细胞，甲状腺细胞，肾细胞 原始生殖细胞，滤泡细胞，脂肪细胞 巨噬细胞（肺、肝），树突状细胞，神经元 悬浮型 B细胞，T细胞 猪细胞培养的一般步骤 取材 一般说来，猪的所有组织均可用于培养，但实际上只有幼年组织（尤其是胚胎组织和分化程度低的组织）比较容易培养。从猪体内取材时，应严格保持无菌，防止污染。对其它暴露于外界的组织，应将所取组织放入含二性霉素（2ug/ml）、青霉素（500u/ml）、500ug/ml） min。取材后最好立即培养，否则应把组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中置4(C储存，但存放时间不宜超过24小时。[2] 细胞分散与分离 细胞的分散主要分为机械分散法、酶消化法和螯合剂分散法。机械法一般用于某些软组织，如猪脑及猪胚胎等。将研碎组织通过特殊孔径的不锈钢纱网即可获得单细胞悬液，但对组织有一定损失。对于间质较少的软组织和传代细胞宜用胰蛋白酶消化，对纤维组织和上皮组织等宜用对胶原有较强消化作用的胶原酶，而对某些硬组织可将两酶联合应用。螯合剂分散法中常用Versen液，用其消化传代细胞温和且毒性较小。 细胞的分离纯化一般采用离心法或免疫磁性分离，或利用细胞对不同表面的粘附性质。就离心法而言，目前常用的密度梯度离心法还并不完善，而有报道指出用该法对猪胰岛进行纯化的进步将有赖于对梯度介质溶剂生化构成的不断改进，而非对新密度梯度介质的开发。[3] 细胞的分装、培养及传代 根据细胞计数，用生长液将细胞悬液稀释成(3~5((105个/ml，每个培养皿内分装一定量。一般接种细胞数应视细胞种类、来源于胚胎或成体以及细胞活性的不同而定。经37(C孵箱静置培养，于2~3天后换一次生长液，上皮样细胞约在5~7天长成单层细胞，成纤维细胞则以3~4天或5~7天为宜，换维持液成为维持细胞后，可进行实验研究。这种长成单层的原代细胞可进行传代培养，用细胞分散剂处理，制成单个细胞悬液分装传代。[2] 猪细胞培养的应用 猪到人异种移植基础研究 因为用于移植的人体器官长期短缺，将猪器官用于移植的可能性引起了研究人员的极大兴趣。最为首要的难题是抗体介导的超急性排斥反应，它可能通过多种策略包括采用转基因猪[4]和/或耗竭人抗猪IgM和IgG抗体[5]加以解决。而目前，对于猪器官植入人体后可能发生的细胞免疫的性质知之甚少，Batten等[6]建立了人体与猪内皮细胞相互作用的体外模型，以研究几种主要人细胞因子（IFN-(，TNF-(，IL-1(，IL-4）对猪内皮细胞表达MHC和粘附分子的影响，并试验了经细胞因子作用后的猪主动脉内皮细胞能否诱导T细胞发生更强的反应。该研究从异种移植的观点提出了人TNF的炎症前驱作用，而抗TNF抗体的应用将有效地抑制细胞介导的免疫应答。在另一研究中，Vallee等[7]将人外周血单核细胞与汇合后的单层猪主动脉内皮细胞共同培养，并通过体外实验排除了猪MHCII分子在人淋巴细胞对猪内皮细胞的增殖反应中的作用。 成功异种移植的另一障碍为急性血管排斥，该病理过程以移植物微血管血栓形成及弥漫性纤维蛋白单体沉积为特征。Kalady等[8]利用培养的猪主动脉内皮细胞对此加以研究，分别用人血清和猪自体血清刺激该细胞后，取培养基测定纤溶活性，结果显示人血清使其抗纤溶活性增高93%，因此证明猪的血管内皮在人的异种反应抗体（xenoreactive antibodies） 猪内皮细胞培养的应用 有关猪内皮细胞的报道很多，上述的异种移植研究成果即