LPA抑制缺氧无血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡研究.pdfVIP

LPA 抑制缺氧无血清诱导的大鼠骨髓间充质干细胞 凋亡的研究1 陈静海，徐瑞霞，邓琳子，朱伟铨，丛祥凤，胡盛寿，陈曦 中国医学科学院心血管病研究所， 中国协和医科大学阜外心血管病医院，北京 (100037) E-mail ：chenxifuwai_2006@ 摘 要：本研究以缺氧/无血清条件模拟心梗后缺血微环境，观察溶血磷脂酸（LPA ）抗MSCs 凋亡作用。Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，并进一步采用Western blot方法检测 LPA对Akt和ERK1/2的激活作用。结果表明：LPA对缺氧/无血清诱导的MSCs凋亡的抑制作 用与阻止caspase-3的活化有关，并且其抗凋亡作用是通过激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2通路 实现的。 关键词：骨髓间充质干细胞，缺氧/无血清，凋亡，LPA ，Akt ，ERK 1. 引言 随着冠心病发病率的逐年增高，缺血性心脏病已成为危害人类健康的重大疾病之一。缺 血引起的心肌细胞死亡导致斑痕组织形成及心室壁顺应性降低，最终降低心功能引发心力衰 竭。近年来，随着干细胞研究的兴起，骨髓间充质干细胞以其具有多向分化潜能、来源充足、 体外易扩增、无免疫排异等优点，已经成为细胞移植治疗心肌梗塞的首选[1,2] 。然而，移植 细胞在缺血心肌组织中较低的存活率限制了此方法的临床治疗效果[3] 。如何提高移植细胞的 存活率，实现细胞再生、最终改善心功能，是目前细胞移植治疗缺血性心脏病亟待解决的问 题。 溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid ，LPA ）是本课题组一直关注和研究的一种脂类信 号分子，我们先前的研究发现 LPA 能够促进心肌细胞肥大[4]、对心脏成纤维细胞的生长具 有双重调节作用[5] 。那么，LPA 是否能促进 MSCs 存活呢？本研究旨在以缺氧/无血清条件 模拟缺血心肌微环境诱导 MSCs 凋亡[6]，深入探讨 LPA 是否能够抑制 MSCs 凋亡，从而为 提高移植细胞的存活率、改善临床治疗效果提供实验依据和理论基础。 2. 材料与方法 2.1 实验材料 SD 大鼠（Sprague–Dawley rats，二级动物），80g，雌性，购于北京大学医学部实验动 物中心，所有研究都经阜外心血管病医院实验动物委员会批准。 2.2 主要试剂及仪器 LPA和Hoechst 33342 购自SIGMA公司；特优级胎牛血清（FCS ）、IMDM培养基、胰 蛋白酶购自GIBCO公司；缺氧培养盒（hypoxic GENbox Jar ）购自法国 BioMérieux®sa公司； Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司。Caspase-3酶活检测试剂盒购 自Bivision 。 PD98059 、U0126 、LY294002 、Wortmannin 、Anti-phospho-Akt 、Anti-Akt 、 Anti-phospho-ERK和Anti-ERK均购自Cell Signal公司。 CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410-220, USA)，荧光倒置显微镜（Olympus, JAPAN)，全 1本课题得到 2006 年度教育部博士点基金资助项目（20050023016 ）的资助。 -1- 自动酶标分析仪 (Thermo electron corporation Multiskan MK3, USA) ， 流式细胞仪（FACSC- LSR ，Becton- Dickton ，USA) 。 2.3 实验方法 2.3.1 大鼠骨髓间质干细胞的分离(全骨髓法) 动物腹腔麻醉。75% 乙醇消毒。在超净台内分离腿部肌肉，取出股骨和胫骨。用 PBS 洗去残留血液， 剔除骨骼上残留的骨骼肌，除去长骨两端的软骨帽。轻轻刮去一层骨端的 骨垢，用完全培养液(含 10%FCS 的IMEM)缓慢冲出骨髓腔中的细胞，接种培养瓶。原代培 养 24 h 后换液。4～5 天后细胞可达到 70～80 ％融合，以 1：3