甲醛降解论文：甲醛降解菌筛选、关键酶基因克隆表达和固定化细胞降解特性研究.docVIP

甲醛降解论文：甲醛降解菌筛选、关键酶基因克隆表达和固定化细胞降解特性的研究 【中文摘要】甲醛作为一种原生毒素,对生物体有很强的毒害作用,是室内空气污染的主要污染物之一。如何有效的控制空气中的甲醛污染,已引起人们的高度关注。通过生物法降解甲醛将成为去除甲醛的有利手段。本文旨在筛选甲醛降解菌,对甲醛代谢的关键酶进行克隆分析,并对固定化细胞的降解条件进行研究,为构建高耐受高效率降解甲醛的工程菌和生物法去除室内甲醛污染的应用奠定基础。利用以甲醛为唯一碳源的基本培养基,分离得到了一株甲醛降解新菌株,经形态学观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA的同源性分析,初步鉴定该菌株属于甲基杆菌属(Methylobacterium),命名为Methylobacterium sp. XJLW。该菌株在初始驯化阶段,甲醛耐受浓度为0.1g/L,且在液体培养基中生长缓慢。实验室已经分离得到的一株甲醛降解菌株Pseudomonas putida xyz-zjut,该菌株的甲醛最高耐受浓度为6g/L,降解效率高达0.114g/L·h。经比较,选取实验室已经分离的高活性高耐受甲醛菌株Pseudomonas putida xyz-zjut作为甲醛关键酶基因的研究对象。根据NCBI中公布的Pseudomonas putida基因序列,设计了两对特异性引物,克隆了甲醛同化作用关键酶—丝氨酸羟甲基酶(SHMT)和甲醛异化作用关键酶—甲醛脱氢酶(FDH)的基因。丝氨酸羟甲基酶基因大小为1254 bp,能编码417个氨基酸,甲醛脱氢酶基因全长1206 bp,编码401个氨基酸,与已报道的Pseudomonas putida F1及Pseudomonas putida KT2440具有较高的同源性。将甲醛脱氢酶基因连接至原核表达质粒pET-28b中,通过PCR,酶切鉴定及SDS表明fdh基因成功克隆至载体pET-28b上,构建好的pET-28b-fdh在宿主E. coli BL21(DE3)成功获得了表达, SDS中的目标蛋白质大小为43 kDa,与预期一致。但在检测工程菌降解甲醛的情况时发现甲醛降解效率没有明显的提高,推测原因可能是甲醛脱氢酶虽然表达了,但是大部分蛋白在宿主中是以包涵体形式存在,使得蛋白不具有甲醛脱氢酶活性。以海藻酸钙为包埋载体固定Pseudomonas putida xyz-zjut降解甲醛取得较好的效果。固定化细胞降解甲醛的海藻酸钙颗粒中的最适细胞密度为1.0×10~8 cells/mL,在温度30℃,培养基为MgSO4·7H2O 0.2 g/L,(NH4)2SO4 2.4 g/L,微量元素母液0.1 mL,pH值9的条件下,甲醛的降解效率高达0.107 g/L·h,高于国内外同类研究水平。该固定化细胞颗粒可应用于降解甲醛的反应器中,为生物法降解甲醛奠定基础。 【英文摘要】As a native toxin, formaldehyde has strong toxic effect on the organism and is one of the main pollutants of indoor air pollution. How to control formaldehyde pollution in the air has caused great concern, and degradation of formaldehyde by microorganism will be an effective way for the removal of formaldehyde.The aim of the research was to isolate a strain which can metabolize formaldehyde, then investigate the key enzymes in degradation of formaldehyde and the characteristics of immobilized cells by gel beads. The research provided a basic study for constructing a high tolerance and efficient engineering bacteria for formaldehyde degradation and the application for biological treatment technology about the indoor formaldehyde pollution.One bacterial strain which was capable to use formaldehy