REACH法规 第四卷译稿-18.docVIP

B.17.基因突变—IN 体外 1.测定方法 此方法是和OECD TG476,哺乳动物细胞基因突变测定（1997）同样的测定。 1.1.引言 体外哺乳动物基因突变测定可被用来探知由化学物质诱导的基因突变。合适的细胞群包括L5178Y老鼠淋巴瘤细胞，CHO，CHO-AS52和中国大鼠细胞的V79阵列，以及TK6人类淋巴胚细胞。在这些细胞阵列中，最常用的是TK,HPRT,和XPRT.TK,HPRT和XPRT探知不同幅度的基因事件。TK和XPRT可以探知常染色体的基因事件，但不能探知X染色体，而HPRT可以。 在哺乳动物基因突变测定中，可用建立细胞阵列或细胞品系的培养环境。细胞根据在培养液中的生长能力和自然有丝分裂频率的稳定性来选择。 测定基本都需要外加物质交替环境。这物质交替环境不能完全模仿哺乳动物样品的生长条件。应注意控制条件避免导致结果不能反映特属于某器官的突变。不能反映内部突变的阳性结果可能是由于PH值的改变或毒性太高。 这个测定被用来测定可能的哺乳动物基因突变和诱癌因素。许多在此测定中呈阳性结果的化合物是生癌物质。然而，这个测定和致癌之间无绝对的关联。这种关联决定于药品种类。越来越多的证据表明还有不少诱癌因素这个测定不能探知，它们似乎是通过其它细菌细胞中没有的机制起作用。 见B部分的总引言。 1.2.定义 正向突变：从亲代类型突变导致催化合成基因对应的蛋白质的酶的功能丧失或改变。 碱基替代突变：物质使DNA的一对或几对碱基发生突变。 移码突变：物质使DNA分子中的一个或成对的碱基发生增添或缺失。 表现型表达时间：未改变的基因被新改变的基因替代的时间。 突变频率：观察到的变异的细胞数除以总的细胞数。 相对总增长：随着时间的过去，细胞数目相对于控制细胞数的增长。计算相对于阴性测定的间歇期增殖数目乘以相对于阴性测定的繁殖效率。 相对间歇期增长量：表达期过后相对于阴性测定的细胞增长数目。 生活体：表达期后在选择条件下的培养皿中，被处理细胞的繁殖率 存活率：在处理结束时被处理细胞的繁殖率；存活率通常以与控制细胞数相比的形式表示。 1.3.测定方法原理 细胞中胸苷激酶（TK）缺陷，由于突变新种TK+/....TK-/-抵抗TFT的毒性效应的。TK细胞对TFT敏感，从而抑制了细胞的新陈代谢，并阻止了进一步的细胞分裂。因此，突变细胞在TFT存在下可以增生，而正常的含TK的细胞却不能。类似地，在HPRT或XPRT中有缺陷的细胞是通过对TG和AG的抵抗而被选择的。在哺乳动物基因突变测定中，若被测物是与选择性试剂有关的主要基础类似物或一化合物，则应该仔细判断测定物的性质。例如，对突变细胞和非突变细胞，任何被怀疑对测定物毒性的选择性试剂都应仔细研究。因此，当测定化学药品与选择性试剂结构相关时，选择性体系或试剂的使用必须被证实可行。 将处于间隔期或单分子培养基的细胞在有和没有物质交替的环境中加入测定物，一段合适时间后再做次培养以确定毒性，并在变异选择之时使形状得以表达。毒性通常用测定相对繁殖效率（存活率）或处理期以后的相对总增长（存活率）来确定。处理液使在生长环境中经过充足的时间获得的，从而使诱导新种的性状得到最佳的表达。测定突变频率是将已知数目的细胞置于包含选择性试剂的环境中探知突变细胞，再将已知数量的细胞置于不含选择性试剂的环境中测定繁殖效率（存活率）。经过一段合适的培养时间，点数细菌数目。突变频率从选择性环境中的突变突变细菌数目和非选择性环境中的突变数目推得。 1.4. 测定方法描述 1.4.1. 准备 1.4.1.1细胞 此测定中使用了大量的细胞类型，包括L5178Y,CHO,CHO-AS52,V79或TK6 细胞。此测定所用的细胞类型必须对化学诱变剂有显著的敏感性,繁殖率高,还要有稳定的自然突变频率。细胞必须检查是否被污染，若被污染则不能使用。 测定设计时要预先确定测定限和准确度。细胞数，基液和测定物浓度应反映这些参数。处理后仍存活的最小细胞数目及测定每阶段所用的最小细胞数取决于自然突变频率。经验规律是用自然突变频率反函数十倍的细胞数。尽管如此，建议使用最少106个细胞。足够的细胞体系的历史资料可用来指示可靠的测定操作。 1.4.1.2.介质和培养条件 应选用合适的介质以及培育条件（培养容器，温度，CO2浓度和温度）培养应根据测定中选择性体系和细胞类型来选择。培养条件的选择尤其重要，要使之确保表达期细胞的最佳生长以及变异和非变异细胞的增殖能力。 1.4.1.3.培养的准备 细胞是从繁殖培养液中增殖的，于37℃在培养液中种植和培育。在此测定之前，必须除去先前存在的突变细胞。 1.4.1.4.新陈代谢活动 细胞应当存在于有或没有合适的新陈代谢活性的系统中。 最普遍使用的系统是从用酶诱导基因预处理过的啮齿类动物样品的肝脏中提取的线粒体馏分。