大鼠牙周炎牙正畸移动后整合素β3mRNA变化实验的研究.pdfVIP

大鼠牙周炎牙正畸移动后整合素β3mRNA变化的实 验研究1 1 2 2 张京剧 陈扬熙 肖立伟 1上海太平洋口腔医院正畸中心, （200080 ） 2 四川大学华西口腔医院正畸科，(610041) E-mail （cyxlfx@ ） 摘 要： 目的 对大鼠牙周病与正常牙正畸移动中整合素 β3mRNA 表达变化进行研究。 方 法 用原位杂交方法检测牙周病与正常牙正畸移动后β3mRNA 转录水平的变化。结果 正常牙 与牙周炎牙移动后 12 小时与 3 天后，牙周膜内破骨细胞整合素β3 mRNA 有阳性表达，但表 达较弱。在牙槽骨内的骨髓腔内有大量细胞有整合素 β3 mRNA 的阳性表达，且表达较强。 结论 在正常牙移动及牙周炎牙移动中，整合素β3 参与破骨细胞前体向破骨细胞转化及破 骨细胞迁移和粘附。 关键词：整合素 整合素β3 破骨细胞 1. 引 言 破骨细胞表达的β3组整合素αvβ3是破骨细胞表达水平最强的整合素，是其主要粘 附分子。破骨细胞整合素αvβ3配体为 VN，其介导的细胞粘附与破骨细胞的迁移分化及其 与骨基质的粘附有密切关系[1]。 在牙周炎和正畸牙移动中，破骨细胞是骨吸收的核心细胞。破骨细胞整合素β3的表 达是否参与了牙槽骨的改建和吸收？本实验用原位杂交方法探测整合素β3 mRNA转录水平 的变化，对牙周炎与牙移动中牙周组织与整合素表达的关系进行探讨。 2. 材料与方法 2.1 实验设计 选用10周龄雄性成年SD大鼠96只 （体重350g±，四川大学华西实验动物中心提供）随 机分为正常牙加力组、牙周炎牙加力组。牙周炎牙齿模型在缝线缝扎和高糖饮食一个月后 获得[2]。牙齿加力方法为：用结扎丝将NiTi螺旋弹簧的一端结扎于磨牙颈部，弹簧的另一 端结扎于两个切牙上并用粘结剂固定，使弹簧拉伸，力量为50g，使磨牙受到近中方向的拉 力，形成大鼠磨牙近中移动动物模型。分别在加力后0 天、 1天、2天、3天、5天、7天、 每一时间点处死动物，每组8只。进行标本制备和组织切片。一级子标题（小四号，宋体， 1 本课题得到教育部高等学校博士点科研基金项目（20020610063）资助。 - 1 - 加粗） 2.2实验方法 原位杂交（In Situ Hybridzation ） 2.2.1 主要试剂及设备 兔整合素β1，β3 基因mRNA 链原位杂交实验试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提 供。 试剂盒中含有：胃蛋白酶(x10，Pepsin)、预杂交液、整合素β1， β3 寡核甘酸探针杂 交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、生物素化抗兔 IgG、SABC-POD、生物素化过氧化物酶。 原位杂交所用探针采用整合素的三相寡核甘酸探针，经地高辛高效标记。 整合素β3 寡核甘酸探针序列： (1) 5′—GACAC CTGTG AGAAG TGCCC CACCT GCCCA—3′ (2) 5′—GGATG ACTGT GTCGT CAGAT TCCAG TACTA—3′ (3) 5′—GCTAA ATTTG AGGAA AGGCG CGCCA GGAGC—3′ DEPC（美国 Sigma 公司） 2.2.2 原位杂交实验方法 石蜡切片脱蜡至水，阻断内源性过氧化物酶活性，22 分钟。→5％(w／w)DEPC 水洗，每次 5 分钟，2 次。→暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃，30 分钟。 →5mol／L 磷酸盐缓冲液 PBS (phosphate buffer solution, )洗，每次 5 分钟，3 次,DEPC 水洗 1 次；90％、95％、100％DE