通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA特异性.pdfVIP

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2017-08-31 发布于安徽
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通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA特异性.pdf

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北京大学学报 ( 医学版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vo1．41 No．6 Dec．2009 - 技术方法 · IncreasingspecificityofrealtimePCR todetectmicroRNA through primerdesign andannealingtemperatureincrease HEXiang-jun ，ZHANGQi，LIUYu-jing，PANXiu—ying (InstituteofClinicalMolecularBiology＆CentralLaboratory，PekingUniversityPeople’sHospital，Beijing100044，China) ABSTRACT Objective：T0investigatethenon—specificandinaccurateamplificationincasesofhighly similarsequencesamongfamilymembersandthelengthheterogeneityofmaturemicroRNA (miRNA)， andfindaconditionthatdiscriminatesmaximallyamongsimilarmiRNA familymembersanddetectsthe accurateexpressionlevelofmiRNAs．Methods：Primerswiththeirmismatchesand／or3 endatdifferent positionsweredesigned．Amplificationefficiencieswerecomparedusingmatchedandvariousmismatched primersby RNA．tailingand primer．extension RT—PCR atdifferentannealing temperatures．Expression levelsofseveralmiRNAsinmousebrain werecomparedusing miRNA specificprimerswith different termini．ResIllts：Raisingannealingtemperatures12 ℃ 一14qC abovetheT oftheprime~ maximally increasedamplificationspecificitywithoutsacrificingsensitivity．Primersdesignedwiththeirterrainionor nearvariantpositionscouldefficientlydiscriminatebetweenmiRNA isoforlTIS．Usingprime~ thattemr ina— tedbeforetheendofthematuremiRNA didnotmissthedetectionofshortermaturemiRNA andprovided accurateexpressionlevels．Conclusion：Carefulprimerdesignandhigherannealingtemperaturecanin— creasespecificityandaccuracyofrealtimePCR miRNA detection． KEYW0RDS MicroRNAs：Reverse transcriptasepolymerasechain reaction；DNA primers；Geneex- pressionprofiling 通过引物设计和提高退火温度提高实时定量 PCR检测 microRNA的特异性何湘君，张旗，刘玉京，潘秀英 (北京大学人民医院临床分子生物学研究所，中心实验室，北京 100044) [摘要]目的：了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似，以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR 定量检测结果的影响，寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法：采用 RNA加尾和弓l物延伸实时定量RT—PCR法，设计不同位置错配的引物，以克隆到质粒中的全长成熟 miRNA为模板，比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miR