多糖的提取1.docVIP

油樟叶多糖的提取 100 g干燥油樟叶粉末，按料液比1：20比例加入80％浓度的乙醇，80 ℃水浴回流提取4 h，过滤（滤液另行保存），残渣60℃干燥过夜，按料液比1：20加水浸泡15min，95℃水浴提取，过滤，滤液减压浓缩（约80℃）至约100 m，用95％乙醇调含醇量为80％，静置过夜，4000 r/min离心过滤，沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，常温真空干燥得粗多糖，计算粗多糖得率。1、葡萄糖对照品溶液的制备 将葡萄糖于105℃干燥至恒重，精密称100.0 mg，置100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解，定容至刻度，摇匀即得葡萄糖标准溶液（1.0 mg/mL葡萄糖）。 2、检测波长的选择 精密量取对照品溶液和供试品溶液分别4.0 mL，分别置100 mL两瓶中定容，分别吸取1.0 mL于两具塞试管中，另取1.0 mL蒸馏水代替葡萄糖溶液为空白对照。分别加入0.06%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，摇匀后立即置冰浴中冷却2 min，密封试管口，再同时置沸水浴中加热10 min，取出，自来水冷却至室温10 min，在400～800nm扫描测试，寻找两种溶液的最大吸收波长。 3、标准曲线的绘制 精密量取葡萄糖对照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL分别加入10个100 mL量瓶中定容，分别吸取1.0 mL于10支具塞试管中，另取1.0 mL蒸馏水代替葡萄糖溶液为空白对照。分别加入0.06%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，摇匀后立即置冰浴中冷却2 min，密封试管口，再同时置沸水浴中加热10 min，取出，自来水冷却至室温10 min，在最大波长(626nm)处测定吸光度。以葡萄糖对照品溶液浓度(C，mg/L)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。 4、供试溶液的制备 精密称取油樟叶粗多糖0.2 g，加50 mL蒸馏水溶解，过滤，滤液转至100 mL容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀即得。 5、 精密度试验 精密量取对照品溶液4.0 mL，6份，按标准曲线绘制方法操作，测定吸光度，计算RSD值。 6、稳定性试验 取同一油樟叶粗多糖样品，在制备供试溶液0，1，2，3，4 h后加入蒽酮－硫酸溶液，按标准曲线绘制方法操作测定吸光度，计算RSD值。 7、重复性试验 取同一油樟叶粗多糖0.2 g，5份，按供试液配制方法处理，测定其总多糖含量，计算RSD值。 8、回收率试验 取已知油樟叶总多糖含量的油樟叶粗多糖0.2 g，5份，分别精密加入葡萄糖对照品（30 mg），按供试液配制方法处理，测定其油樟叶总多糖含量，计算RSD值。 9、样品含量测定 精密取样品溶液1 mL，用水稀释，定容至100 mL，精密吸取供试溶液1.0 mL，按标准曲线绘制方法测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算油樟叶总多糖含量。#OH 的测定 参考Fenton 反应体系模型, 采用固定时间反应法, 在相同反应体积的反应体( 818mmolPL H2O2 , 9mmolPL Fe2+ 015mL, 9mmolPL 水杨酸2乙醇溶液015mL) 加入一系列不同浓度的多糖溶液, 并以蒸馏水作参比, 与试剂空白液作比较, 510nm处测量各浓度下的吸光度A. ①：对羟基自由基的清除作用，利用Fenton体系测定多糖对Fe2﹢催化过氧化氢产生·OH。的清除能力，由于·OH可以特异地使番红花红褪色，根据褪色程度用比色法测量·OH的含量。每支试管中分别加入0.15mol／L PH=7.4的磷酸缓冲液1,5ml。260ug／番红花红0.2ml。10mmol／L EDTA-Na2-Fe2+ 0.7ml，再分别加入不同浓度的试样10ml，最后加入2%H2O2 0.8ml，混合均匀后于37℃水浴保持30min，空白对照以蒸馏水代替，空白组则以蒸馏水代替试样和EDTA-Na2-Fe2+于520nm测吸收光度值，并以Vc做对比， 清除率E(%)=（A样品－A空白）／（A对照－A空白）×100% 采用Fenton反应模型产生·OH，加入水杨酸捕捉·OH产生有色物质，该物质在51nm有强吸收，若在反应体系加入水杨酸竞争清除·OH的物质，会使有色物质减少， E=（A空白－A多糖）／A空白×100% ②：对超氧阴离子体系的清除作用，采用邻苯三酚自氧化法，在一定条件下，邻苯三酚能够自氧化产生·O2，加入一定量的多糖溶液课对·O2产生不同的抑制作用，进而导致光吸收的值变化，取0.05mol／L PH=8.2Tris-hcl缓冲液5ml于试管中，分别加入1ml一定量浓度的多糖试液，置于25℃水浴中预热20min，再加3mmol／L邻苯三酚0.4ml困云，于25℃水浴中准确反应4min，立即用Hcl0.5ml终止反应，并在320nm处测吸光度，空白对照组以相同体积Tris-