实验十三酮体的生成和利用.docVIP

实验十一　酮体的生成和利用 一、酮体的生成和利用定性测定 【目　的】 通过实验证明肝脏中酮体生成作用。 【原　理】 本实验利用丁酸作用底物，与肝组织匀浆（含有酮体生成酶系）保温后即有酮体生成。酮体可与含亚硝基铁氰化钠的显色粉反应产生紫红色化合物。而经同样处理的肌肉匀浆，则不产生酮体，因此与显色粉作用不产生显色反应。 【试　剂】 1、0.9%氯化钠溶液。 2、洛克氏（Locke）溶液　氯化钠0.9克、氯化钾0.042克、氯化钙0.024克、碳酸氢钠0.02克、葡萄糖0.1克，将以上药品混合溶于水中，溶解后加水至100毫升。 3、0.5N丁酸溶液　取44.0克丁酸溶于0.1N NaOH溶液中，并用0.1N NaOH溶液稀释至1000毫升。 4、M/15磷酸缓冲液（pH7.6）量取M/15 Na2HPO4溶液86.8毫升和M/15 NaH2PO4溶液13.2毫升混合即可。 5、15％三氯醋酸溶液。 6、显色粉　亚硝基铁氰化钠1克，无水碳酸钠30克，硫酸胺50克，混合后研碎。 【操　作】 1、肝匀浆和肌匀浆的制备　取小鼠一只，断头处死，迅速剖腹，取出肝脏和肌肉组织，剪碎，分别放入匀浆器中，加入生理盐水（按重量：体积为1:3），制备成匀浆。 2、取试管四支，编号后按下表加入各种试剂。 试 　　管 试 　　剂 1 2 3 4 洛克氏溶液（滴） 15 15 15 15 0.5N丁酸溶液（滴） 30 — 30 30 M/15磷酸缓冲液（滴） 15 15 15 15 肝匀浆（滴） 20 20 — — 肌匀浆（滴） — — — 20 蒸馏水（滴） — 30 20 — 3、将上列四支试管摇匀后，放置于37℃恒温水浴中保温。 4、40～50分钟后，取出各管，各加入15％三氯醋酸20滴，摇匀混合，离心5分钟（3000转／分）。 5、分别取出上述各管离心液放于有凹白瓷反应板上，每凹放入显色粉一小匙，观察所产生的颜色反应，并说明原因。 二、酮体生成与利用的定量测定 【基本原理】 在肝脏中，脂肪酸经β氧化生成乙酰辅酶A，再合成酮体，酮体包括乙酰乙酸、β－羟丁酸和丙酮三种化合物。肝脏不能利用酮体，必须经血液运至肝外组织特别是肌肉和肾脏，再转变为乙酰辅酶A而被氧化利用。 本实验以丁酸为底物，与肝匀浆一起保温，然后测定肝匀浆中酮体生成量。另外，在肝匀浆和肌肉匀浆共存的情况下，再测定酮体的含量，在这两种不同条件下，由酮体含量的差别即可帮助我们理解上述理论。 酮体的检测方法很多，常用于定性试验的有亚硝基铁氰化钠法，此法对乙酰乙酸比丙酮灵敏（5倍以上）；专一用于丙酮定量的碘仿试验法、水杨醛试验法，还有与二硝基苯肼缩合成二硝基苯腙后比色测定的方法。本实验采用碘仿试验法测定丙酮含量。 测定的原理是，在碱性溶液中碘可将丙酮氧化成为碘仿，再以硫代硫酸钠滴定剩余的碘，计算所消耗的碘，由此可计算出由丁酸氧化生成丙酮（作为酮体的代表）的量。反式如下： 碘将丙酮氧化成碘仿 2NaOH+I2→NaOI+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH 用硫代硫酸钠滴定剩余的碘 NaOI+NaI+2HCI→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 酮体是脂肪酸代谢的中间产物，在正常情况下，其产量甚微；糖尿病时由于糖代障碍，体内大量动员脂肪供能，若肝内酮体生成速率超过肝外氧化利用酮体的速率，即可导致血中酮体浓度增高，尿中也可能出现酮体，这种状况称为酮症。 【试剂与器材】 一、试剂 1、0.1％淀粉溶液 2、0.9％NaCl溶液 3、15％三氯醋酸溶液 4、10％NaOH溶液 5、10％HCl溶液 6、0.4N正丁酸溶液：取5ml正丁酸溶于100ml 0.5N NaOH溶液中。 7、0.1N碘溶液：称取I2 12.5g和KI 25g，放入烧杯中，加水溶解，然后放入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混匀，用标准0.1N Na2S2O3溶液标定之。 8、0.02N Na2S2O3 溶液：称取Na2S2O3·5H2O 24.82g和无水碳酸钠400mg溶于1000ml刚煮沸并冷却的蒸馏水中，配制成0.1N溶液，用0.1NKIO3溶液标定，临用时将已标定的Na2S2O3溶液稀释成0.02N。 9、0.1NKIO3溶液：准确称取KIO3（相对分子质量为214.02）3.5670g溶于水后，倒入1000ml容量瓶内，加蒸馏水至刻度。 吸取0.1N KIO3溶液20ml于锥形瓶中，加入KI 1g及6N硫酸5ml，然后用上述0.1 N Na2S2O3 溶液滴定至浅黄色，再加1％淀粉3滴作指示剂，此时溶液呈蓝色，继续滴定至蓝色刚消失为止。 计算Na2S2O3溶液的准确当量浓度。 二、器材 1、5ml微量滴定管