大肠杆菌磷酸转移酶系统蛋白-蛋白复合体三维结构.docVIP

大肠杆菌磷酸转移酶系统蛋白-蛋白复合体的三维结构 Alan Peterkofsky1*, Guangshun Wang2, Daniel S. Garrett2, Byeong Ryong Lee1, Yeong-Jae Seok3, and G. Marius Clore2* 摘要 大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸：葡萄糖磷酸转移酶系统（PTS）包括一系列负责在转移过程中从磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）向葡萄糖转移磷酸基团的蛋白质。磷酸载体蛋白之间以及与调节目标之间相互作用的机制适合用核磁共振光谱的方法研究。阐明了酶I的氮末端结构域和HPr之间以及HPr和酶IIAGlc之间的复合体的三维解的结构。HPr和酶I、IIAGlc和糖原磷酸化酶的结合界面的分析揭示出在这些相互作用中包含了一个在HPr上的共同表面。同样，在IIAGlc上的共同表面同HPr、IIBGlc和甘油激酶相互作用的表面。因此，一定存在一个为了蛋白—蛋白相互作用并具有PTS特性的共同的基序。 简介 一些组成性的和可诱导的大肠杆菌葡萄糖转移系统由于在细胞膜存在特别的葡萄糖识别蛋白（通透酶）并且能影响同葡萄糖磷酸化相耦连的葡萄糖转移的过程而被定义(Postma et al., 1996)。磷酸基团的来源是细胞内的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。从能量的角度来看，PEP直接磷酸化通透酶的胞质组分是可能的。然而，这个过程是非常复杂的；有许多的胞质蛋白介导了从PEP到通透酶的磷酸转移（酶II）。酶I（EI）直接被PEP自身磷酸化，P酶I影响了通过磷酸载体蛋白HPr转移到酶II的磷酸转移。这个系统（PEP：葡萄糖磷酸转移酶系统，PTS）的复杂性很明显是由于PTS的多功能能力，除了催化糖基转移（见图.1）之外，它还调控其他的系统。因此，酶I可能通过磷酸化乙酰激酶来调控三羧酸循环(Fox et al., 1986)。有人认为HPr调控着糖原磷酸化酶的活性(Seok et al., 1997)。酶I—HPr配合似乎在向化性的调控方面发挥着作用（Lux et al., 1995）。葡萄糖专一的酶II（IIAGlc）具有多种调节的相互作用。利用磷酸化的程度，它影响了腺苷酸环化酶、甘油激酶和非PTS通透酶的活性（Postma et al., 1996）。 对于包含在通过PTS进行磷酸转移的过程以及PTS蛋白参与调控过程的机制的理解在很大程度上是通过蛋白组分的相互作用的种类的三维结构的可视化来实现的。人们已经利用X衍射晶体学和NMR对PTS的单个的蛋白（酶I、HPr、IIA）进行了广泛的特征分析。然而，除了甘油激酶—IIAGlc复合体(Feese et al., 1994)，没有一个PTS蛋白和其他组分或者和调控配伍的复合体被成功的结晶。 核磁共振（NMR）光谱学已经成功地被人们用于解决蛋白—蛋白复合体的结晶中遇到的问题。酶I和HPr之间以及HPr和IIAGlc之间的氨基末端结构域的三维解已经成功地得到。这些PTS蛋白复合体的特性将在这里描述。 酶I—HPr复合体 PTS的第一步包括由酶I的PEP产生的自身磷酸化。PEP的结合位点被定位在一个具有二个结构域的C端结构域中，而磷酸化的活性位点（His189）在N端结构域中（LiCalsi et al., 1991），磷酸化的酶I转移它的磷酸基团到HPr的活性位点His15。当含氨基末端的一半的酶I（EIN）可以被PEP自身磷酸化的时候，这个蛋白结构域保持反向转移一个磷酸基团到HPr的能力，表明同HPr残基的结合位点在EIN（Seok et al., 1996）。想要降低完整EIN晶体的结构一直都没有成功，但是EIN的结构已经被X晶体衍射(Liao et al., 1996)和NMR (Garrett et al., 1997a)解析了。EI或者EIN和HPr的混合物已经被用于共结晶试验，但没有成功。 EIN—HPr复合体（~40k Da）是到目前为止被NMR解析的最大的结构之一（Garrett et al., 1999）。这个结构测定采用了为了指定的目的以及为了特异地观察EIN和HPr之间的分子间核Overhauser增强（NOE）接触而利用的多种同位素标记（15N, 13C 和/或 2H）的蛋白质的组合去简化光谱的多维异核NMR光谱技术。此外，残基两极耦连技术也被用来提供对于决定复合体中两个蛋白的方向极为有用的长程定向信息。 在图.2 中显示了两幅阐释整个复合体的丝带图。EIN包含两个亚结构域：α结构域（33-143残基）显示为红色，是一个由H1、H2/H2、H3和H4四个螺旋组成的四螺旋束；α/β结构域（1-20和148-230残基），显示为蓝色，由四股平行的β片层(β1-β4)组成的一个?三明治和一个三股反向平行的β片层(β1, β5, β6)组成；