抗冻基因在拟南芥中表达.docVIP

抗冻基因在拟南芥中的表达 实验目的 掌握植物细胞DNA的提取方法。 掌握构建基因表达载体的方法及将其导入蝴蝶兰中的方法。 掌握植物组织培养的方法。 实验原理 在液氮冷冻下研磨烟草破碎细胞，利用十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）和β-巯基乙醇蛋白变性剂，再经加热使蛋白变性与DNA分离，加之EDTA螯合金属二价离子、氯仿的抽提使DNase对DNA的作用降到最低，经离心获得含DNA的上清液，在用乙醇沉淀核酸，得到总DNA。 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体。用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮体，采用碱性SDS溶液裂解菌体的细胞壁，使质粒缓慢释放出来，同时整个液体的pH为12-12.5，双链DNA变成单链，当pH调至中性并有高盐浓度存在下，断裂成线性的单链细菌染色体DNA相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质形成沉淀，离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机容剂使质粒DNA脱水，离心得到质粒沉淀。 PCR技术是在1985年建立起来的在细胞体外合成DNA的一种方法。依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模版的特性，在附加的两个引物与模版杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA，包括模版变形、退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的循环，使包括在两个引物5，端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特异的