24脱氢胆固醇还原酶抗氧化应激作用的功能.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（５）：５０～５４ ２４脱氢胆固醇还原酶抗氧化应激作用的 ? 功能结构域鉴定 １ １ １ １ ２ 芦秀丽 　刘剑利 　曹向宇 　侯芳芳 　高　兵 （１辽宁大学生命科学院　沈阳　１１００３６　２沈阳医学院基础医学院　沈阳　１１００３４） 摘要　２４脱氢胆固醇还原酶（ＤＨＣＲ２４）具有抗氧化应激引起的细胞凋亡的作用，但其机制尚不 ? 清楚。先前的实验数据显示在细胞水平ＤＨＣＲ２４可能具有清除过氧化氢的作用。在生物信息学 方法预测的基础上，构建了以ｐＩＶＥＸ２．４ａ为载体的人 ＤＨＣＲ２４基因及其两种功能域缺失的突变 型重组表达载体ｐＩＶＥＸ２．４ａＤＨＣＲ２４（野生型）、ｐＩＶＥＸ２．４ａＯＲＤ（预测氧化还原功能域保留型） ? ? 和ｐＩＶＥＸ２．４ａＣＴＲ（碳端保留型），通过体外快速翻译表达系统ＲＴＳ５００进行体外大量表达，经提 ? ＴＭ 纯得到各种ＤＨＣＲ２４纯化蛋白。ＦｌｕｏｒｏＣａｔａｌａｓｅ 荧光过氧化氢酶体外检测实验首次证明野生型 ＤＨＣＲ２４具有较强的过氧化氢清除能力，且 ＤＨＣＲ２４ＯＲＤ突变型具有与野生型同等强度的过氧 ? 化氢清除活性，而ＤＨＣＲ２４ＣＴＲ突变型则失去了此能力，提示ＤＨＣＲ２４的氧化还原功能域在其清 ? 除过氧化氢作用方面起着重要作用。为了进一步研究其抗氧化应激作用的生理学意义，利用双 重免疫荧光染色法对ＤＨＣＲ２４在细胞内的定位情况进行了调查。结果表明，ＤＨＣＲ２４定位于内质 网，提示其内质网的定位可能与其抗氧化应激作用有关。 关键词　２４脱氢胆固醇还原酶　抗氧化应激　功能域鉴定　细胞内定位 ? 中图分类号　Ｑ８１４ 　　２４脱氢胆固醇还原酶是胆固醇合成过程中催化最 究所内分泌代谢惠赠本实验室保存。ＤＨＣＲ２４过表达腺 ? ［１］ 后一步反应的酶，在胆固醇的合成中起重要作用 。 病毒为本实验室已构建载体。ＰＣＲ试剂盒、Ｔ４ＤＮＡ连接 最近的研究还揭示其可能在细胞信号转导和细胞增殖 酶和碱性磷酸酶购自ＴａＫａＲａ公司；各种限制性内切酶 ［２］ 过程中发挥重要作用 。有报道指出ＤＨＣＲ２４具有抗 购自基因公司；Ｔｒｉｚｏｌ总 ＲＮＡ提取试剂盒购自美国 ［３］ 氧化作用 ，研究也证实了其抗氧化的功能。为了进 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ＤＮＡ回收试剂盒购自杭州维特洁公司； 一步确认ＤＨＣＲ２４的过氧化氢清除作用，并确定其可 高糖ＤＭＥＭ培养基及胎牛血清购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司； 能的活性功能域，研究中利用基因工程的方法，构建了 转染用试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；体外 不同截短长度的ＤＨＣＲ２４基因的表达载体，并在体外 转录和翻译选用 ｒａｐｉｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ （ＲＴＳ５００ 的表达体系进行表达、纯化，并对其清除过氧化氢作用 ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ）；蛋白的提纯选用ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎ ? 的活性分别进行了鉴定和比较。 （ＨｉｓＳｐｉｎＴｒａｐ；ＧＥｈｅａｌｔ