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第 29卷 第 1期 热 带 作 物 学 报 Vo1．29 No．1
2008年 2月 CHINESEJOURNALOFTROPICAL CROPS Feb．2008
胶孢炭疽菌 T—DNA插入突变体库
的构建及其分子分析
黄贵修 薛迎春 卢 昕
海喜宝南誊省嘉热著带农业有害生物检测监控重点篓实验喜室海南’儋州571737
摘 要 利用根癌农杆菌介导的T—DNA插入遗传转化体系转化卡亡果炭疽菌 SC2菌株，共获得抗潮霉素B突
变体 4680个，平均每转化 1．0x10个炭疽菌分生孢子可得到 300-980个突变体，且潮霉素抗性在多次传代实
验中得到稳定遗传。随机挑取 38个突变体进行PCR检测，均可扩增出 1条约 1．2kb的 目标谱带，说明突变体
为T—DNA插入引起；进一步的 Southernblot杂交分析结果表明，在随机挑选 的20个突变体 中，有 1个 (5％)
为三拷贝T—DNA插入 ，4个 (20％)为双拷贝插入 ，剩余 的 15个 (75％)为单拷贝插入 。
关键词 胶孢炭疽菌 T—DNA插入突变 PCR Southern杂交
中图分类号 $667．7 $435．621．2+2 Q785
DeGroot等首次利用根癌农 杆菌介 导转化 (Agrobacteriumtumefaciens—mediatedtransformation，
ATMT)的方法构建了一个丝状真菌的转化体系 ，可 以在不同的真菌组织如原生质体、分生孢子、菌丝体
以及担子果上实现成功转化 [11，且转化效率高于PEG介导法 ]。 目前，该技术 已经成功地应用于 曲霉
(spergillusniger)、炭疽菌 (Colletotrichumgloeosporioides)、镰刀菌 (Fusariumvenenatum)、木霉 (TrichodeFma
reesei)、脉孢霉 (Neurosporacro．saa)和稻瘟菌 (Magnaporthegrisea)等丝状真菌的诱变上[5-6]。将AFMT方法
用于转化炭疽小种如C．gloeosporioides，C．higginsianum和 C．graminicola已有报道 ，但对于胶孢炭疽菌
[Colletotrichumgloeosporioides(penzig)PenzigSaccardo]的转化效率较低 的问题仍未得到较好地解决，且
与转化相关的多个参数的影响也未见有详细报道 。笔者利用二元质粒载体 pBHt2，建立一个新的能够用
于胶孢炭疽菌的遗传转化体系，同时，对所获得的部分插入突变体进行了分子鉴定，为 以后利用 ATMT
方法研究胶孢炭疽菌分子致病机理提供依据 。
1 材料和方法
1．1 材 料
1．1．1 供试菌株和质粒 致病性较强的丰l=果炭
疽菌 (ColletotrichumgloeosporioidesPenz)菌株 SC2r~，
由本实验室分离和保存 (见图 1)。质粒 pBHt2：。]
(含 trpC启动子启动表达 的潮霉素磷酸转移酶基
因， )和农杆菌菌株Agl一1，由中国科学院微生
物研究所何朝族研究员转赠 。
l-1．2 培养基 PDA培养基 ，LB(Luria—Bertani)
培养基 ，常规方法配制 。MM (Minimalmedium)液
体 培 养 基 ：K2HPO 2．05g，KH2PO 1．45g，NaC1
0．15g，MgSO4·7H20 0．5g，CaC12·2H2O 0．067g， 图 1 芒果炭疽菌菌株 SC2的分生孢子形态
海南省教育厅高等学校科研资助重点项 目(Hjkj200321)、中央级公益性科研 院所基本科研业务费专项 (No．2007hzslJ003)、中国热带农
业科学院科技基金项 目(RKY0704)
黄贵修 男，1968年生，博士。研究方向：植物内生菌资源研究与利用。电话：0898E-mail：hgxiu@vip．163．corn
收稿 日期：2007—09—04 修 回日期：200
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