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克隆的Amp抗性筛选 PCR筛选 EcoR1和Xho1双酶切筛选 表达筛选 9.7万 6.6万 4.3万 3.1万 CBD 2.6万 P10 3.2万 P10-CBD 5.8万 测序验证 P10(3.2万)蛋白的纯化 9.7万 6.6万 4.3万 3.1万 P10 实验设计 1. 酶切位点的选择 2.载体的酶切方案 3.引物的设计 4.RT-PCR程序的设计 5.基因的酶切方案 6.克隆的筛选方案 7.蛋白功能研究方案 1.酶切位点的选择 (1)RRSV-S10基因的下载 (2) RRSV-S10-ORF的获取 (3) 表达质粒pTXB1 MCS的分析 (4) RRSV-S10-ORF酶谱的分析 基因下载 (2) RRSV-S10-ORF的获取 (3)表达质粒pTXB1 MCS的分析 限制性内切酶 缓冲溶液 反应温度 Nhe1 M 37 oC Not 1 H+BSA+TritonX-100 37 oC EcoR 1 H 37 oC Xho 1 H 37 oC Sap 1 NEB buffer 4 25 oC 同尾酶的分析 非同尾酶 2.载体的酶切方案 当EcoR 1切开载体时, Xho 1无法切动; 当Xho1 切开载体时, EcoR 1可切开载体. (1) EcoR 1 切开 AATTC CTCGAG-------- G GAGCTC-------- (2) Xho1 切开 -------GAATTC C -------CTTAAG GAGCT 所以,载体酶切方案为: H buf, 37oC, Xho 1酶切2 hours以上;再加EcoR 1 酶切过夜 3.引物设计 P+:(EcoR 1 ) 5’GGAATTCATGCCTTTCGTGCAATTC 3’ P+引物验证 P-( Xho I):5’CCGCTCGAGCTCTGCGTCATCACCAAAG3’ P-引物分析和验证 引物合成 P+ (EcoR 1 ) : 5’GGAATTCATGCCTTTCGTGCAATTC 3’ P-( Xho I): 5’CCGCTCGAGCTCTGCGTCATCACCAAAG3’ 送公司合成, 2 OD, 1OD/tube分装. 使用时加ddH2O至10 pmol/ul浓度. 实验流程 RRSV-dsRNA抽提 RRSV感染的病稻,切碎研磨,加入抽提缓冲液 加入酚,裂解细胞,变性蛋白 离心,得上清(含DNA, mRNA, dsRNA等核酸) CF11柱可以特异吸附dsRNA 获得纯化的dsRNA,电泳鉴定 RT-PCR反应 1. dsRNA, P+,P-混合物, 加热1000C 5min, 2.快速插入冰中, 3. 加入RT缓冲液和RTase,反应1h 4. 取部分RT产物,作为PCR反应的底物,配好PCR反应体系,PCR扩增,电泳鉴定. 900bp M S10 基因, 载体的双酶切 基因: EcoR1和Xho1双酶切, H buf, 370C过夜 载体: H buf, 37oC, Xho 1酶切2 hours以上;再加EcoR 1 酶切过夜 基因和载体浓度鉴定 M 1 2 3 4 5 1,2,3: 不同浓度入DNA; 4: 胶回收pTXB1载体 5.胶回收S10基因 胶回收 电泳 割胶回收 电泳鉴定浓度 连接 1、总体积为10 ul ; 2、基因mol /载体mol≈ 10 ; 【 平端≈15】 3、16 ℃连接过夜; 转化 1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中; 2、混匀,冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s----热击,促进DNA进入cell 4、冰上1~2min--使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)--外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h--Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s,浓缩100ul 8、涂板(Amp板)--抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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