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引物探针设计原则
张庆
Application Specialist
Molecular Cellular Biology
引物设计原则
• 选择合适的靶序列
–根据需要选择保守、特异、碱基分布均匀的区域
–荧光PCR扩增产物不宜过长： 150bp
• 引物长度： 15～30bp
• Tm值：一般在55～60℃，上下游尽可能一致
• G+C含量：一般为40～60％
• 4种碱基的随机分布
–不存在聚嘌呤和聚嘧啶
–3’端不应超过3个连续的G或C
引物设计原则
• 引物的特异性：
–与非特异序列的同源性70％，连续互补碱基8个；
• 引物之间不应有互补序列，尤其避免3’端的互补；
• 引物互补区域尽量避开扩增片断的二级结构；
• 引物的3’端不进行修饰；
• 密码子兼并：扩增编码区域，引物的3’端不终止于
密码子的第三位，因为密码子的第三位易发生兼并。
Taqman探针设计原则
• 探针与扩增产物间有完全互补的序列；
• 序列不易形成二级结构；
• Tm值高于引物（10℃）；
• 探针的5’ 端第一个碱基不能是鸟嘌呤（G）；
• 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G；
• 检测SNP或突变时，区分位点尽量位于探针中央；
• 探针5’端尽可能地接近引物3’端；
• ……
SNP或基因突变位点在MGB探针中的位置
DO NOT
polymorphism
PLACE HERE
NN N N N N N N N N N N N N N N N N N
Try to position the If necessary, put the
polymorphism here polymorphism here
(central third) (region of MGB)
探针设计技巧
• 基因表达：探针设计跨过两个外显子
R Q
TaqMan探针
3
Exon 1 Exon 2 Exon 3
设计完的序列必须比对验证
Always BLAST the primers and probes !
标记探针的荧光分子的选择
荧光染料 最大发射波长(nm) 用途
FAM ~520 报告荧光
JOE ~550 报告荧光
VIC ~550 报告荧光
TAMRA ~580 淬灭荧光
NED ~580 报告荧光
CY-3 ~5
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