赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用.pdfVIP

维普资讯 四川 大 学 学 报 医 学 版 JSichuanUniv (M edSciEdi?2oo…8；39(3)：3‘5l1—35-4- Univ Ed 赖型钩端螺旋体 Loa22重组质粒的蛋白表达和对 巨噬细胞的毒性作用* 张 英，鲍 朗△，朱海龙，黄 毕，章 乐，张会东 四川大学华西基础 医学与法医学院 感染免疫研究室 (成都 610041) 【摘要】 目的 对赖型钩端螺旋体 Loa22基因进行表达和功能研究 。方法 构建赖 型钩端螺旋体Loa22成熟 肽重组质粒 ．经异丙基一D一硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋 白诱导表达 ，SDS—PAGE和 WesternBlotting 检测 目标蛋 白表达情况。经亲和层析获得 目标蛋 白并作用于小 鼠巨噬细胞 ANA一1，检测细胞上清液 中乳酸脱氢酶 (LDH)活力、四氮唑复合物 (XTT)吸光度值和细胞凋亡率 以评价其细胞毒性 。结果 成功构建 Loa22成熟肽原核 表达质粒 ，通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽，该蛋 白使培养 ANA一1细胞上清液 中LDH活力升高，XTT吸光度 值下降，细胞凋亡率增加。结论 Loa22对 ANA一1具有明显的毒性效性，该基因可能是致病钩体 的一个重要毒力 相关基 因。 【关键词】 钩端螺旋体 外膜蛋 白Loa22 巨噬细胞 细胞毒性 【中 图分类号】 R377．5 Expression and Identification ofGeneLoa22 from theVirulentStrain ofSerovarLaiofL．interrogansand Its CytotoxicitytoM acrophages ZHANG Ying，BA0 Lang ，ZHU Hai-long，HUANGBi，ZHANGLe．ZH ANG Hui-dong． ResearchUnitofInfectionandImmunity，WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine， SichuanUniversity，Chengdu610041，China 【Abstract] Objective TostudythefunctionofLoa22genefrom virulentserovarLai．L．interrogansby expressing itsprotein．M ethods TherecombinantplasmidwithLoa22wasconstructedand itsexpression was inducedbyIPTG．TheexpressionproductwasidentifiedbySDSandW esternBlottingandpurified with GST—affinitychromatography．Thepurified protein wasapplied tOm ice macrophagesANA一1cells purifiedby GST-affinitycolumnandexertedtOANA一1cells．ThecytotoxicityofpurifiedproteintOANA一1wasevaluatedby detecting LDH activity in culture medium ，XTT aborbtion and apoptosis ration． Results The recombinant plasmid with Loa22 mature peptide wasconstructed successfully and the protein was purified subsequently． Significant higher levelofLDH activity and apoptosis ratio and lower XTT absorption were observed by comparisonofexpressionproteintreatedcellsandthoseuntreated．Conclusion Loa22ha