对米曲霉细胞外蛋白酶提纯以及特征描述.docxVIP

对米曲霉细胞外蛋白酶的提纯以及特征描述通过（NH4）2SO4和乙醇分流法，以及二乙氨乙基---交联葡聚糖A-50和羟磷灰石层析法，可以将米曲霉EI212细胞外蛋白酶分离成两个活性部位。蛋白酶I和II的分子量通过凝脂过滤法的测量，分别约为70,000和35,000。对于蛋白酶I，络蛋白和血红蛋白水解作用的最优PH值为6.5，温度应保持在60oC，对于蛋白酶II最优PH为10，温度应保持在45oC，至于明胶的水解作用，对于两种酶最优的PH均为6.5，温度均为45oC。在PH范围为6到8，温度保持在30oC的条件下放置60分钟，酶类的状态都是稳定的。两种蛋白酶的酶类活性会被Cu2+所激活，而被Fe2+、Fe3+、Hg2+以及Ag+所抑制。卤化物（例如：N-氯代丁二酰亚胺）以及二异丙基氟磷酸都会对蛋白酶II产生抑制作用。含硫基的试剂，例如氯汞基苯甲酸盐，以及碘醋酸盐会对蛋白酶I产生抑制作用。含硫基的化合物加速两种酶类的活动。在之前的交流（12）中，我们都报告了米曲霉EI212与其他米曲霉产生的细胞外蛋白酶的产量以及类别方面的不同。同时，报告也显示，备用酶类的获得是通过两种酶类的混合或者是通过持有两种在不同的最优PH水平下表现不同的功能团。在本文中，我们对于蛋白酶系统的离析、提纯以及特征描述都提供了非常详细的内容。物料及方法培养基以及生长介质。培养（指定的蛋白酶EI212）历史以及维护，在文本中都有描述（19）。发酵作用以及酶的离析。Kundu等人描述了如何从发霉的米糠中离析出酶类（12）。酶类的提纯。将粉末状的（NH4）2SO4缓慢的加入发霉米糠的上层澄清液，并不断搅拌，直至其达到60%的饱和度。使用离心分离，保持6,000 x g20分钟，将经过2小时搅拌形成的细小颗粒沉淀物收集起来，并使其悬浮在蒸馏水中，对这些蒸馏水进行多次的透析，保持温度在5oC进行48小时，再用乙醇进行再次的沉淀。将通过离心分离（6,000 x g）得到的沉淀部分溶解入50ml0.02M的磷酸盐缓冲液，PH值为7.0，再通过二乙氨乙基---交联葡聚糖A-50（Pharmacia Fine Chemicals，瑞典）柱（2个24cm）对其进行分馏，从而进一步的提纯。结合活性蛋白酶的部分（6至20），并用3倍体积的乙醇对其进行再沉淀。使离心分离（6,000 x g）15分钟得到的沉淀物再次悬浮于20ml0.01M磷酸盐缓冲液，PH6.8，再通过柱层析法以及羟磷灰石凝胶（3个58cm）进行进一步的提纯。羟磷灰石的制备是根据Tiselius等人的研究来进行的。将蛋白酶I的活性部分61至73以及蛋白酶II的活性部分103至113进行合并。这些部分可以用作对酶类进行特征描述。蛋白酶的检验。蛋白酶的活性可以通过Anson（3）的方法来确定，该方法使用络蛋白和血红蛋白作为酶作用物，并使用明胶消化方法（6）。对于络蛋白和血红蛋白的消化，采用2%的“alkaliloslich络蛋白”溶液以及血红蛋白（E. Merck AG, Darmstadt，德国），对于明胶消化采用4%的明胶（E. Merck AG, Darmstadt，德国）。研究中使用了PH值为3.0至5.5的柠檬酸盐—磷酸盐缓冲液（0.1M），PH值为6.0至8.0的磷酸盐缓冲液，PH值为8.5至9.0的硼酸缓冲液，以及PH值为9.5至10.5的重碳酸盐缓冲液。对洗脱出的酶（蛋白酶I蛋白质含量66ug/ml,蛋白酶II蛋白质含量46ug/ml）进行稀释（1:5），然后取1ml稀释后的酶加入每份5ml的缓冲液试剂。对于络蛋白与血红蛋白，将反应混合物培养10分钟；对于明胶培养需3小时，温度保持在40oC。对于络蛋白与血红蛋白的消化，在所描述的环节下，生产出650nm,0.1个光学密度单位的变化的酶的量，被定义为1U的蛋白酶活性。准确的活性值表现为每毫克蛋白质的蛋白酶活性。对于明胶消化，蛋白酶活性是通过每毫克蛋白质氨基酸氨的是释放量来确定的。蛋白质的估测。蛋白质的估测是根据Lowry等人的方法进行的，他们使用了透明的牛类血浆白蛋白（Armour Pharmaceutical有限公司）作为标准。分子量的确定。分子量是通过Andrews的方法来确定的，是利用交联葡聚糖(Pharmacia Fine Chemicals)比较实验所得以及已知蛋白质的蛋白酶洗脱体积，例如胰蛋白酶（23,800），胃蛋白酶（35,500），卵清蛋白（45,000），牛血浆白蛋白（65,000）以及血红蛋白（68,000）。电泳。蛋白酶部分的同质性可以通过纸电泳法进行检验（4）。对蛋白酶部分的电泳是在色谱纸（Whatman no.1）上的Systronix的电泳装置（型号601-1）中进行的，色谱纸条上含有um=0.05,PH值为8.6的巴比土酸盐缓冲液