酒酵母质粒稳定性和外源蛋白质产量.pdfVIP

营养物震荡高密度培养提高重组酿酒酵母 质粒稳定性和外源蛋白质产量 张小里 夏诏杰 贾志华 赵彬侠 (西北大学化学工程学系，陕西西安710069) 摘要 表达外源Q一淀粉膝的重组眼酒醉母蔺株在生长铃止期表现出质拉德定性增加的趋势，当培养 过程中脉冲流加天然氮派酵母贵形成其浓度襄荡时这一现象得到重现，性流1流加管养物结合醉母青 浓度衷荡的高密度培养方案使质杜保持率德定在90%以上，录大菌体密度、最大。一沈粉璐活力分别 达刘36.4创L和207.6UI.L. 关.词 f组醉母 质粗趁定性 高密度培养 基因产品 1 前官 质粒稳定性是关系基因工程发酵产率的决定性因素。质粒不稳定通常缘由于细胞分裂时的 分离不稳定性和DNA的缺失、插人、重排引起的结构不稳定性两种情形。因为携带质粒细胞相 对于质粒缺失细胞生长速率缓慢，质粒不稳定性在培养过程中呈扩大趋势，即竟争性不稳定性 扩大了质粒不稳定程度。一般在大规模培养中采用施加选择性压力来克服质粒不稳定性，然而 这种基于培养基组成筛选转化体的方法未必符合成本、安全方面的要求，况且持续保持选择性 压力常常并不可行。酿酒醉母 (Saccharomycescereuisiae)是重要的基因工程受体菌，因安全、易 培养和可提供转译后加工环境等优点而受到重视;尤其在安全方面，既可以避免大肠杆菌 (E.- COLt)体系滋生热源的间题，又不象动物体系易感染病毒和夹带致癌基因，因而被广泛应用于表 达与人体相关的药用蛋白【】‘。重组酵母一般采用与大肠杆菌不同的质粒选择性标记— 氨基酸或 核酸碱基营养缺陷。但是，产物表达、后修饰或分泌却常常需要丰富的营养条件，因而放大培 养难于持续保证选择性压力。质粒不稳定影响了外源基因产物生产效率，在探讨重组酵母培养 条件和流加培养补料方式的基础上[z.31，本文提出营养条件震荡稳定质粒的方案，通过培养过程 中实施营养物脉冲流加，提高非选择性条件下携带质粒细胞的生长竟争，以确立适合高密度培 养的重组醉母质粒稳定方案。 2 材料方法 2.1 菌种 质粒pNA3含SUC2启动子，Killer28kD信号序列和PGK终止子等基因片段，小白鼠唾液a- 淀粉酶基因作为目的基因插于信号序列和终止子之间。该重组质粒含2(m质粒的复制起始部位 (。)和选择性标志 (饰1)opNA3转化S.cerevisiae的分泌变异株20B一12，得重组醉母S.cemvi- siae20B一12(pNA3)。受 ‘ller28前导序列指导和寄主的分泌变异诱导，外源蛋白质被直接分泌 至培养液中。 2.2 培养墓 天然成分培养基 (YPD)用作活化菌种。酵母膏10g/L，蛋白陈10砂L,葡萄糖20以Lo 半合成选择性培养基 (SSM)用作菌种保藏、质粒稳定性测试及种子培养。葡萄糖适量，酵 母基础氮 (YeastNitrogenBaseW/OAminoacid,Sigma公司产品)适量，维生素BI0.01g/L，维生 素B60.001g/L，生物素1x10-g/L，肌醇5x10-3g/L,D一泛酸钙0.01g/L,pH6.0a 半合成非选择性培养基 (SUM)用于生成菌落或诱导生产阶段培养，除SSM培养基所有成 份外，再添加色氨酸或天然氮源酵母膏。培养基pH均为6.0a 26 2.3 培养方法 种子培养:于装有10mL半合成培养基的50mL锥形瓶中，在3090,150转/分下摇振培养约 17小时。 发酵罐培养:将摇瓶培养液以7%的接种量接种于装有21,培养基的发酵罐 (B.BraunBiotch International,Germany,BIOSTATB2,BIOSTATB2)中，进行补料分批培养，温度30(C,pH6.0, 调整通气量和搅拌转速保持溶解氧浓度为80%;用于脉冲添加的葡萄糖和酵母膏分别配成300砂 1和200g/L浓度，恒流量流加的SSM培养基配成50倍浓缩液。 2.4 测定方法 菌体浓度:培养液稀释后测定吸光度OD-，实验测知1OD*相当于细胞干重0.33g/Lo葡 萄糖浓度:用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶试剂盒测定 (上海荣盛生物试剂厂)。 质粒稳定性:用稀释培养液涂布SUM平板，于30(C恒温培养，将所长出的单菌落用消毒 牙签接种在SSM平板上进行培养，长出菌落者判定质粒未脱落。以长出菌落的百分比表示质粒 稳定性 (PS);a一淀粉酶活力:表示基因表达