草鱼PKZ功能分析.pdfVIP

lIIIIIIU IIIIIIII II IIIIl 摘要 Y2142307 摘要 PKR．1ike(PKZ)是近年来在鲫鱼、斑马鱼(Daniorerio)、大西洋鲑(Salmo idella)d?报道的一 salar)、稀有觞鲫(Gobiocyprisrarus)和草鱼(Ctenopharyngodon kinase Z．DNA 2个 containingbindingdomain)。有趣的是，PKZ的C．端也具有1 RNA 保守的elF2a激酶催化域，与PKR(double．strandeddependentproteinkinase) 非常相似。 初步研究表明PKZ与PKR非常相似，也与宿主细胞抗病毒有关。如鱼类 PKZ基因的本底表达非常微弱，当干扰素等诱导后，表达上调。此外，与其eIF2a 激酶家族其他成员一样，斑马鱼PKZ、大西洋鲑PKZ也能够抑制细胞蛋白质的 合成。尽管如此，对Z．DNA如何调节及激活鱼类PKZ还不清楚。 了原核表达载体，并在体外进行表达、纯化。对所得草鱼PKZ全长蛋白进行功 能分析表明：原核表达的草鱼PKZ本身就已经被磷酸化了。以磷酸酶使之去白 磷酸化后，PKZ就失去了激酶活性。我们还发现Z．DNA可以使去白磷酸化的PKZ I：C却无法使之重新活化。体内实验表明： 重新激活，然后磷酸化elF2a。而Poly 草鱼PKZ能够在翻译水平上极大地抑制荧光素酶的产生，说明它能够抑制蛋白 质的翻译。其198位点突变后，几乎完全失去阻碍翻译的功能。此外，调节区Zq 的缺失对其功能也影响极大。 另外，草鱼PKZ启动子的序列分析表明其上存在干扰素调节因子I(IRF一1) 的结合位点。基于此，我们利用原核表达的IRF．1的多肽与PKZ启动子序列进 行了琼脂糖凝胶阻滞实验，结果表明，IRF．1可与PKZ启动子结合。这个结果为 我们构建真核表达载体，进一步在体内分析二者的结合情况，以及探索IRF．1调 控草鱼PKZ的转录做好了准备。 依据本实验中所得结果，以及分析以往对PKZ的研究成果，我们在不排除 前人提出的PKZ抗病毒通路的前提下，提出一条新路径以供参考。这条通路与 以往PKZ激活的“被动”模式不同，我们认为PKZ有可能存在一条内源性激活 通路，这种激活模式对于细胞应激占据主动地位具有重要意义。而此通路的提出 在一定程度上弥补了旧通路的不足之处。 关键词：PKZ；Z．DNA；elF2m翻译抑制；启动子；草鱼 ABSTRACT ABSTRACT Inrecent kinase hadbeen years，thePKR-like(PKZ)genes reportedsuccessively insometeleost asCaPKZ fish，such in et Goldfish(Carassiusauratus)(Hua1．，2004)， DrPKZin et inAtlanticsalmon Zebrafish(Danio rerio)(Rothenburga1．，2005)，SsPKZ et in