EGFP在肿瘤细胞中表达分析 PC.docVIP

EGFP在肿瘤细胞中的表达分析 彭超 222008371042030 西南大学生命科学学院，重庆 400715 摘要：肿瘤基因靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗研究最活跃的领域之一， 其目的是在不损伤正常细胞的前提下，进行选择性杀伤或抑制肿瘤细胞。目前已有大量靶分子被分离和鉴定，如端粒酶、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等， 其中端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达。近年来研究人员利用人端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase，hTERT）基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中高效表达的特点，构建用hTERT 启动子调控其它抗肿瘤基因的表达载体， 靶向破坏肿瘤细胞已取得了较大进展。由于慢病毒载体具有可感染细胞并整合DNA序列的、可转移较大的基因片段等优点。本研究通过构建由hTERT 基因启动子介导绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体, 并转染肿瘤细胞, 检测该启动子在端粒酶阳性的肿瘤细胞中eGFP 的表达情况。 关键词：eGFP hTERT 肿瘤 TOPO克隆 脂质体介导法 第一部分 文献综述 靶向诱导肿瘤细胞凋亡 近年来研究发现， 肿瘤的形成与凋亡功能的失调密切相关， 提出肿瘤的发生可能是肿瘤细胞异常增殖和其凋亡调控功能受到抑制共同作用的结果。一些研究人员利用hTERT 启动子的肿瘤特异性，在其下游连接凋亡相关的抑癌基因或细胞因子， 导入端粒酶阳性的肿瘤细胞， 从而靶向诱导肿瘤细胞发生凋亡，已取得良好效果[7]。Caspases 是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶， 在细胞的凋亡过程中发挥重要作用， 其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者。Yang 等[8]利用构建的hTERT/re-Caspase-3系统，同时转染端粒酶阳性的鼻咽癌细胞CNE1、结肠癌细胞HRT-18、胃癌细胞MGC 和端粒酶阴性的正常上皮细胞Hacat， 孵育48h 后，荧光显微镜下观察，肿瘤细胞呈典型的核固缩、核碎裂、核溶解的凋亡形态；流式细胞仪分析显示，三种端粒酶阳性的肿瘤细胞（CNE1、HRT-18和MGC）凋亡率为15%~20%，而端粒酶阴性的Hacat仅为1.5%~3.5%；动物试验将hTERT/re-Caspase-3直接注射在裸鼠肿瘤内， 以不含Caspase-3的hTERT/SEAP 为对照， 连续7d 后观察发现，hTERT/re-Caspase-3能显著抑制裸鼠肿瘤的生长， 证实了hTERT/re-Caspase-3的体内外靶向抗肿瘤作用。Jacob 等[9]构建的hTERT 基因启动子驱动的促凋亡基因TRAIL的表达载体， 也同样证实了其可靶向性诱导端粒酶阳性的胰腺癌和结肠癌细胞发生凋亡。 靶向介导自杀基因抑瘤作用 自杀基因又称前药敏感基因， 将自杀基因导入肿瘤细胞， 可将无毒性药物前体在肿瘤细胞内代谢为毒性产物，进而杀伤肿瘤细胞。常见的自杀基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)基因、细胞色素P450 基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因、大肠杆菌硝基还原酶(NTR)基因等，其中TK 和CD 研究最多。体内外实验证实[10]，利用肿瘤特异性hTERT 启动子介导自杀基因转染肿瘤细胞， 不仅能靶向杀死被转染的肿瘤细胞， 还可通过旁观者效应杀死周围未被转染的肿瘤细胞， 以及远处扩散转移的肿瘤细胞也有凋亡现象。TK 可将无毒性的前体药物更昔洛韦（ganciclovir，GCV）磷酸化为三磷酸更昔洛韦（GCV-TP），抑制细胞DNA 聚合酶， 从而阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡。Tang 等[11] 构建hTERT 启动子调控HSV-TK基因的表达质粒(pGL3-hTp-tk)， 以pGL3-sv40-tk为对照， 同时转染端粒酶阳性的肺癌细胞A549 和端粒酶阴性的正常成纤维细胞MRC-5，发现用GCV 处理后，pGL3-sv40-tk同时抑制A549 细胞和MRC-5细胞的生长， 而pGL3-hTp-tk仅对A549 细胞有抑制作用， 对MRC-5 细胞无影响。NTR 可将CB1954———单功能烷基化合物转化为剧烈的双功能烷基化合物，进而引起DNA 交联。Bilsland 等[12]构建hTERT 启动子调控NTR 基因的载体， 转染宫颈癌、卵巢癌等七种肿瘤细胞和四种正常细胞，Westernblot 分析其仅在肿瘤细胞中表达，且使肿瘤细胞对CB1954 的敏感性增加18 倍，而正常细胞却不受影响。近年双自杀基因联合治疗逐渐成为研究热点，Kong 等[1