高效毛细管电泳测定鸡蛋中三聚氰胺.pptVIP

检测三聚氰胺的方法主要有液相色谱法、 液相色谱-质谱联用法和气相色-谱质谱联用法 毛细管电泳是近十几年发展起来的分离技术 ,具有高效快速、 灵敏度高、 自动化高、 经济环保等优点 ,已成为生物化学和分析化学领域中发展最快的一种分离分析技术。本研究建立了鸡蛋中三聚氰胺的毛细管电泳检测方法 ,操作简便、 分析快速、 稳定可靠且经济环保 ,可作为鸡蛋样品中三聚氰胺测定的初筛方法。如果与质谱或电化学检测器联用 ,可以获得更高的灵敏度。 仪器与试剂 HP3D高效毛细管电泳仪 (德国 Agilent公司 )配二极管阵列检测器;拓展光程毛细管柱 (总长64 . 5 cm,有效长度 56 cm,内径 75μm,德国 Agilent公司 ) ;Waters OasisMCX固相萃取小柱 ( 3 mL,60 mg) ; Effendorf 5804高速冷冻离心机 (德国Effendorf公司 ) ; Sart orius PB2 21 pH计 (德国 Sart ourius公司 )。电泳缓冲溶液: 50 mmol /L甲酸 2 50 mmol /L甲酸铵 (pH 2 . 5,色谱纯 ) ;三聚氰胺标准品 (纯度 99% , Sigma公司 ) ,用 V (20%甲醇 ) ∶ V (水 ) = 2∶ 8混合液溶解成 500 mg/L储备液;三氯乙酸、甲醇等其它试剂均为分析纯;实验用水均为超纯水 。 鸡蛋样品的前处理 生鸡蛋全蛋搅拌均匀 ,准确称取2.0 g,加入20mL 2%三氯乙酸溶液 ,超声10 min、振荡10 min后,以 9000 r /min离心5 min,上清液过固相萃取小柱 ( SPE, 预先用3mL甲醇和3mL水活化小柱),自然流干后分别用 3mL水和3mL甲醇洗涤 ,抽干 SPE柱 ,用5mL5%氨化甲醇(V/V)洗脱。洗脱液在50℃用N2吹干,以500μL20%甲醇-H2O复溶 ,滤膜过滤后上机检测。熟鸡蛋用匀浆机充分匀浆后准确称取2.0g,其余处理过程同生鸡蛋。 实验方法 毛细管电泳运行电压 25 kV; 0 . 35 kPa × 8 s进样;检测波长 232 nm;温度 25 ℃。为提高分析的重现性 ,毛细管在进样前用运行缓冲溶液冲洗 20 min; 进样间用缓冲溶液冲洗 3 min; 测定结束用 0 . 1 mol /LNaOH冲洗 5 min,超纯水冲洗 10 min。三聚氰胺储备液用 20%甲醇 2 水依次配制成 1、5、10、20、40、80和 100 mg/L工作液 ,每个浓度进样 3次 ,以分析物的峰面积和浓度建立校准曲线。 1.分离缓冲溶液的优化对柠檬酸-柠檬酸三钠、甲酸-甲酸铵、Tris碱-盐酸、 乙酸-乙酸铵和磷酸盐 5种缓冲溶液进行比较。结果表明 ,分析物在后2种缓冲溶液中峰展宽;在前3种体系中响应高、峰形好;但在 Tris缓冲体系中信号不稳定; 而柠檬酸根因其在低波长有微弱的紫外吸收导致基线不如甲酸体系平稳 ,最终选择甲酸-甲酸铵为分离缓冲液 结果与讨论 2仪器稳定性分析 在同样的分离条件下使用同一根毛细管柱 ,对同一样品连续测3d,每天进样6次 ,测定其迁移时间和峰面积的相对标准偏差 (RSDs)。结果显示 ,迁移时间的日内与日间 RSDs分别小于0.3%和0.15%; 峰面积日内与日间 RSDs分别小于2.0%和6.0% ,说明本方法的重现性和稳定性均较好。 3提取液的选择 由于三聚氰胺在20%甲醇-水溶液中溶解性较好,乙腈又具有较好的沉淀蛋白作用,所以比较2%三氯乙酸、20%甲醇22%三氯乙酸、20%乙腈22%三氯乙酸3种提取液的提取效果。实验表明，含有甲醇和乙腈的三氯乙酸提取液混浊,过柱困难;而用2%三氯乙酸即可以达到很好的沉淀蛋白的作用,过柱顺利,且回收率高。实验选择2%三氯乙酸为提取液。 4.线性范围、检出限、回收率和相对标准偏差 在上述电泳条件下 ,三聚氰胺的峰面积与其浓度在1～100mg/L范围内呈线性关系。分别6个空白的生、熟鸡蛋样品进行测定 ,测得基线噪声平均值,以3倍信噪比 (S/N=3)为检出限 (LOD),S/N=6为定量限(LOQ),得到三聚氰胺的LOQ为0.25 mg/kg(见图1和图 2)。对空白样品添加0.25、2.5和5.0 mg/kg三聚氰胺进行回收实验 ,每个添加水平平行5次 ,计算其回收率和日内相对标准偏差 ,连续测定3d,计算日间相对标准偏差。结果见表1 5.三聚氰胺在鸡蛋中的分布 对 6种不同阳性鸡蛋的蛋清和蛋黄分别处理 ,每个样品取 2 . 0 g,分别测得蛋清和蛋黄中三聚氰胺的含量。结果显示 ,蛋清中的平均含量比蛋黄高 20%。 * 。 *